1. प्रारम्भिक समझ

यस चरणमा, हामीले केही अवधारणाहरू र शब्दावलीहरू बुझ्न आवश्यक छ, ताकि हाम्रा वरिष्ठहरूका अगाडि गल्तीहरू गर्नबाट बच्न, जस्तै:

प्रश्न: RT-PCR, qPCR, रियल-टाइम PCR, र वास्तविक-समय RT-PCR बीच के भिन्नता छ?

उत्तर: RT-PCR रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन PCR हो(रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन PCR, RT-PCR), जुन पोलिमरेज चेन रियाक्सन (PCR) को व्यापक रूपमा प्रयोग हुने संस्करण हो।RT-PCR मा, एक RNA स्ट्र्यान्डलाई पूरक DNA मा उल्टो ट्रान्सक्राइब गरिएको छ, जुन PCR द्वारा DNA प्रवर्धनको लागि टेम्प्लेटको रूपमा प्रयोग गरिन्छ।
वास्तविक समय-PCR र qPCR(Quantitative Rea-ltime-PCR) एउटै कुरा हो, दुबै वास्तविक-समय मात्रात्मक PCR हुन्, जसको मतलब PCR को प्रत्येक चक्रमा वास्तविक-समय डेटा रेकर्डहरू छन्, त्यसैले सुरु टेम्प्लेटहरूको संख्या सटीक विश्लेषण समायोजन गर्न सकिन्छ।

यद्यपि दुबै रियल-टाइम पीसीआर (वास्तविक-समय फ्लोरोसेन्ट क्वान्टीटेटिभ पीसीआर) र रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन पीसीआर (रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन पीसीआर) लाई आरटी-पीसीआरको रूपमा संक्षिप्त गरिएको जस्तो देखिन्छ, अन्तर्राष्ट्रिय कन्भेन्सन हो: आरटी-पीसीआरले विशेष रूपमा रिभर्स ट्रान्सक्रिप्सनलाई जनाउँछ।PCR, वास्तविक-समय PCR लाई सामान्यतया qPCR (मात्रात्मक वास्तविक-समय PCR) को रूपमा संक्षिप्त गरिन्छ।.

र वास्तविक-समय RT-PCR (RT-qPCR), यो फ्लोरोसेन्ट मात्रात्मक प्रविधि संग संयुक्त रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन PCR हो।: पहिले आरएनए रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शनबाट cDNA (RT) प्राप्त गर्नुहोस्, र त्यसपछि मात्रात्मक विश्लेषण (qPCR) को लागि वास्तविक-समय PCR प्रयोग गर्नुहोस्।धेरैजसो प्रयोगशालाहरूले RT-qPCR, अर्थात्, RNA अभिव्यक्ति डाउन-रेगुलेसनमा अनुसन्धान गर्छन्, त्यसैले प्रयोगशालामा सबैले कुरा गर्ने qPCR ले वास्तवमा RT-qPCR लाई जनाउँछ, तर नबिर्सनुहोस् कि क्लिनिकल अनुप्रयोगहरूमा अझै धेरै DNA परीक्षणहरू छन्।मात्रात्मक विश्लेषण, जस्तै हेपाटाइटिस बी भाइरस HBV पत्ता लगाउने।

प्रश्न: धेरै फ्लोरोसेन्ट परिमाणात्मक PCR पढिसकेपछि, किन एम्प्लीफाइड टुक्रा 80-300bp को दायरा भित्र नियन्त्रण गर्नुपर्छ?

जवाफ: प्रत्येक जीन अनुक्रमको लम्बाइ फरक छ, केही धेरै kb छन्, केही सयौं bp छन्, तर हामीले प्राइमरहरू डिजाइन गर्दा उत्पादनको लम्बाइ 80-300bp मात्र चाहिन्छ, धेरै छोटो वा धेरै लामो फ्लोरोसेन्ट मात्रात्मक PCR पत्ता लगाउन उपयुक्त हुँदैन।उत्पादन टुक्रा प्राइमर-डाइमरबाट छुट्याउनको लागि धेरै छोटो छ।प्राइमर-डाइमरको लम्बाइ लगभग 30-40bp छ, र यदि यो 80bp भन्दा कम छ भने यो प्राइमर-डाइमर हो वा उत्पादन हो भनेर छुट्याउन गाह्रो छ।यदि उत्पादनको टुक्रा धेरै लामो छ, 300bp भन्दा बढि छ भने, यसले सजिलैसँग कम प्रवर्द्धन दक्षता निम्त्याउँछ र प्रभावकारी रूपमा जीनको मात्रा पत्ता लगाउन सक्दैन।

उदाहरणका लागि, जब तपाइँ कक्षाकोठामा कति व्यक्तिहरू छन् भनेर गणना गर्नुहुन्छ, तपाइँले त्यहाँ कतिवटा मुखहरू छन् भनेर मात्र गणना गर्न आवश्यक छ।उही सत्य हो जब तपाइँ जीनहरू पत्ता लगाउनुहुन्छ, तपाइँले मात्र सम्पूर्ण अनुक्रमलाई प्रतिनिधित्व गर्नको लागि जीनको निश्चित अनुक्रम पत्ता लगाउन आवश्यक छ।यदि तपाईं मान्छेहरू गणना गर्न चाहनुहुन्छ भने, तपाईंले मुख र नाक, कान, र चश्मा दुवै गणना गर्न आवश्यक छ, र यो गल्ती गर्न सजिलो छ।

विस्तार गर्न, जैविक अनुसन्धानमा, बिन्दुदेखि क्षेत्रसम्म धेरै अनुसन्धान केसहरू छन्, किनकि कुनै पनि प्रजातिको जीन अनुक्रम धेरै लामो हुन्छ, ब्याक्टेरिया 16S अनुक्रमण जस्ता सबै टुक्राहरू मापन गर्न अनावश्यक र असम्भव हुन्छ, जसले ब्याक्टेरियाको रूढ़िवादी अनुक्रम पूरा गर्नको लागि निश्चित जनसंख्याको संख्याको अनुमान गर्न एसेस गर्दछ।

प्रश्न: qPCR प्राइमर डिजाइनको लागि इष्टतम लम्बाइ के हो?

जवाफ: सामान्यतया, प्राइमर लम्बाइ लगभग 20-24bp छ, जुन राम्रो छ।निस्सन्देह, हामीले प्राइमर डिजाइन गर्दा प्राइमरको TM मानमा ध्यान दिनुपर्छ, किनभने यो इष्टतम एनिलिङ तापमानसँग सम्बन्धित छ।धेरै प्रयोगहरू पछि, यो प्रमाणित भएको छ कि 60 डिग्री सेल्सियस राम्रो TM मान हो।यदि annealing तापमान धेरै कम छ भने, यसले सजिलै गैर-विशिष्ट प्रवर्धन गर्न नेतृत्व गर्नेछ।यदि annealing तापमान धेरै उच्च छ भने, प्रवर्धन दक्षता अपेक्षाकृत कम हुनेछ, प्रवर्धन वक्र को शिखर पछि सुरु हुनेछ, र CT मान ढिलाइ हुनेछ।

प्रश्न: डाई विधि प्रोब विधिबाट कसरी फरक छ?

उत्तर: डाई विधिSYBR ग्रीन Ⅰ, PicoGreen, BEBO, आदि जस्ता केही फ्लोरोसेन्ट रङहरू आफैंबाट प्रकाश उत्सर्जन गर्दैनन्, तर डबल-स्ट्र्यान्ड DNA को माइनर ग्रूभमा बाँधिएपछि फ्लोरोसेन्स उत्सर्जन गर्दछ।त्यसैले, पीसीआर प्रतिक्रियाको सुरुमा, मेसिनले फ्लोरोसेन्ट संकेत पत्ता लगाउन सक्दैन।जब प्रतिक्रिया एनेलिङ-एक्सटेन्सन चरणमा पुग्छ, डबल स्ट्र्यान्ड खोलिन्छ, र डीएनए पोलिमरेजको कार्य अन्तर्गत नयाँ स्ट्र्यान्ड संश्लेषित हुन्छ, र फ्लोरोसेन्ट अणु dsDNA माइनर ग्रूभमा बाँधिन्छ।PCR चक्रको संख्या बढ्दै जाँदा, अधिक र अधिक रंगहरू डबल-स्ट्र्यान्ड डीएनएसँग जोडिन्छन्, र फ्लोरोसेन्ट संकेत पनि निरन्तर बढाइन्छ।डाई विधि मुख्यतया वैज्ञानिक अनुसन्धानमा प्रयोग गरिन्छ।
पुनश्च: प्रयोग गर्दा होसियार हुनुहोस्, डाई मानव डीएनएसँग मिल्नुपर्छ, यसलाई फ्लोरोसेन्ट व्यक्तिमा परिणत गर्न सावधान रहनुहोस्।

डाई विधि (बाँया) प्रोब विधि (दायाँ)
पुनश्च: प्रयोग गर्दा होसियार हुनुहोस्, डाई मानव डीएनएसँग मिल्नुपर्छ, यसलाई फ्लोरोसेन्ट व्यक्तिमा परिणत गर्न सावधान रहनुहोस्।

SYBR हरियो Ⅰ DNA को सानो नालीमा बाँध्छ

अनुसन्धान विधिताकमान प्रोब सबैभन्दा बढी प्रयोग हुने हाइड्रोलिसिस प्रोब हो।त्यहाँ प्रोबको 5′ अन्त्यमा फ्लोरोसेन्ट समूह हुन्छ, सामान्यतया FAM, र प्रोब आफैंमा लक्षित जीनको लागि पूरक अनुक्रम हो।त्यहाँ 3′ अन्तमा फ्लोरोसेन्ट शमन समूह छ।फ्लोरोसेन्स अनुनाद ऊर्जा स्थानान्तरण (Förster अनुनाद ऊर्जा स्थानान्तरण, FRET) को सिद्धान्त अनुसार, जब रिपोर्टर फ्लोरोसेन्ट समूह (दाता फ्लोरोसेन्ट अणु) र क्वेन्चिंग फ्लोरोसेन्ट समूह (स्वीकारकर्ता फ्लोरोसेन्ट अणु) उत्साहित हुन्छन्, जब स्पेक्ट्रा ओभरल्याप हुन्छ र दूरी धेरै नजिक हुन्छ। स्वीकारकर्ता अणु को प्रतिदीप्ति, जबकि autofluorescence कमजोर छ।तसर्थ, पीसीआर प्रतिक्रियाको सुरुमा, जब जाँच प्रणालीमा स्वतन्त्र र अक्षुण्ण हुन्छ, रिपोर्टर फ्लोरोसेन्ट समूहले प्रतिदीप्ति उत्सर्जन गर्दैन।एनिलिङ गर्दा, प्राइमर र प्रोब टेम्प्लेटमा बाँधिन्छ।विस्तार चरणको समयमा, पोलिमरेजले लगातार नयाँ चेनहरू संश्लेषण गर्दछ।DNA पोलिमरेजमा 5′-3′ exonuclease गतिविधि छ।प्रोबमा पुग्दा, डीएनए पोलिमरेजले टेम्प्लेटबाट प्रोबलाई हाइड्रोलाइज गर्नेछ, रिपोर्टर फ्लोरोसेन्ट समूहलाई क्वेन्चर फ्लोरोसेन्ट समूहबाट अलग गर्नेछ, र फ्लोरोसेन्ट संकेत जारी गर्नेछ।प्रोब र टेम्प्लेट बीच एक-देखि-एक सम्बन्ध भएको हुनाले, परीक्षणको शुद्धता र संवेदनशीलताको सन्दर्भमा जाँच विधि डाई विधि भन्दा उच्च छ।प्रोब विधि मुख्यतया निदान मा प्रयोग गरिन्छ।

प्रश्न: निरपेक्ष मात्रा के हो?सापेक्ष मात्रा के हो?

जवाफ: निरपेक्ष परिमाणीकरणले qPCR द्वारा परीक्षण गरिने नमूनाको प्रारम्भिक प्रतिलिपि नम्बरको गणनालाई बुझाउँछ, जस्तै कि 1ml रगतमा HBV भाइरसहरू छन्।सापेक्ष परिमाणीकरण द्वारा प्राप्त परिणाम अर्को सन्दर्भ नमूना सापेक्ष एक विशिष्ट नमूना मा लक्ष्य जीनको मात्रा मा परिवर्तन हो, र जीन अभिव्यक्ति अप-रेगुलेट वा डाउन-रेगुलेट गरिएको छ।

Q: के आरएनए निकासीको मात्रा, रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन दक्षता, र प्रवर्धन दक्षताले प्रयोगात्मक परिणामहरूलाई असर गर्नेछ?
प्रश्न: नमूना भण्डारण, निकासी अभिकर्मकहरू, उल्टो ट्रान्सक्रिप्शन अभिकर्मकहरू, र प्रकाश-प्रसारण उपभोग्य वस्तुहरूले प्रयोगात्मक परिणामहरूलाई असर गर्नेछ?
प्रश्न: कुन विधिले प्रयोगात्मक डाटा सच्याउन सक्छ?

यी मुद्दाहरूको सन्दर्भमा, हामी तिनीहरूलाई तलको उन्नत र उन्नत खण्डहरूमा विस्तृत रूपमा वर्णन गर्नेछौं।
2. उन्नत ज्ञान

रियल-टाइम फ्लोरोसेन्ट क्वान्टीटेटिभ पीसीआरको सन्दर्भमा, हामीले वास्तविकतालाई बुझ्नुपर्छ कि प्रत्येक वर्ष हजारौं वैज्ञानिक अनुसन्धान पत्रहरू प्रकाशित हुन्छन्, जसमध्ये फ्लोरोसेन्ट मात्रात्मक पीसीआर प्रविधि सानो संख्या होइन।

यदि फ्लोरोसेन्ट मात्रात्मक PCR प्रयोग मापन गर्न कुनै सामान्य मानक छैन भने, परिणामहरू व्यापक रूपमा भिन्न हुन सक्छन्।एउटै प्रजातिको एउटै जीनका लागि, एउटै प्रशोधन विधिको साथ, पत्ता लगाउने परिणामहरू पनि व्यापक रूपमा भिन्न हुनेछन्, र ढिलो आउनेहरूलाई उही परिणामहरू दोहोर्याउन गाह्रो हुनेछ।तिमीलाई थाहा छैन कुन सहि हो र कुन गलत हो।

के यसको मतलब फ्लोरोसेन्ट परिमाणात्मक PCR एक धोखा प्रविधि हो वा एक अविश्वसनीय प्रविधि हो?होइन, यो किनभने फ्लोरोसेन्ट परिमाणात्मक पीसीआर अधिक संवेदनशील र अधिक सटीक छ, र अलिकति गलत अपरेशनले पूर्णतया उल्टो परिणाम दिन्छ।सानो घाटा हजार माइल टाढा छ।लेखको लेखकलाई समीक्षकहरूले बारम्बार यातना दिन सक्छन्।एकै समयमा, जर्नलका समीक्षकहरूलाई पनि विभिन्न प्रयोगात्मक परिणामहरूबाट छनौट गर्न गाह्रो हुन्छ।

सबैमा, वास्तविक-समय पीसीआर प्रयोगहरूमा सहमतिको अभावलाई औंल्याउँदै।यस उद्देश्यका लागि, उद्योगका वरिष्ठ वैज्ञानिकहरूले मापदण्डहरू बनाउन थाले,योगदानकर्ताहरूलाई यी मापदण्डहरू पूरा गर्न लेखमा केही आवश्यक प्रयोगात्मक र डेटा प्रशोधन विवरणहरू (आवश्यक डेटा सहित) प्रदान गर्न आवश्यक छ।

समीक्षकहरूले यी विवरणहरू पढेर प्रयोगको गुणस्तरको न्याय गर्न सक्छन्;भविष्यका पाठकहरूले पनि प्रयोग दोहोर्याउन वा प्रयोग सुधार गर्न प्रयोग गर्न सक्छन्।त्यसपछि यसरी प्राप्त प्रयोगात्मक परिणामहरू जानकारी, उच्च गुणस्तर, र प्रयोगयोग्य छन्।

MIBBI (जैविक र बायोमेडिकल अनुसन्धानको लागि न्यूनतम जानकारी -http://www.mibbi.org) अस्तित्वमा आयो।MIBBI एक परियोजना हो जसले प्रयोगका लागि मापदण्डहरू प्रदान गर्दछ।यो प्रकृति मा प्रकाशित छ।यो परियोजना विभिन्न जैविक प्रयोगहरूमा लक्षित छ, जसमा सेल बायोलोजी, माइक्रोएरे, qPCR हामी अहिले छलफल गर्न गइरहेका छौं, आदि, र पाण्डुलिपिहरू पेश गर्दा प्रत्येक प्रकारको प्रयोगको लागि प्रदान गर्दछ।त्यो जानकारी सधैं प्रदान गर्नुपर्छ।

MIBBI परियोजनामा, फ्लोरोसेन्ट मात्रात्मक PCR सम्बन्धी दुईवटा लेखहरू छन्, अर्थात्:
· RDML (रियल-टाइम PCR डेटा मार्कअप भाषा) - वास्तविक-समय मात्रात्मक PCR डेटाको लागि एक संरचित भाषा र रिपोर्टिङ गाइड;
· MIQE (मात्रात्मक वास्तविक-समय पीसीआर प्रयोगहरूको प्रकाशनको लागि न्यूनतम जानकारी) - वास्तविक-समय मात्रात्मक PCR प्रयोगहरूको बारेमा लेखहरू प्रकाशित गर्नको लागि न्यूनतम जानकारी।
पहिले, RDML को बारेमा कुरा गरौं, शब्दावली विशिष्टता।

यदि सबै कुराको लागि कुनै मानक परिभाषा छैन भने, छलफल जारी राख्न असम्भव छ, त्यसैले परीक्षामा सर्तहरूको व्याख्या यति महत्त्वपूर्ण छ।
फ्लोरोसेन्ट मात्रात्मक PCR प्रयोगमा प्रयोग गरिएको शब्दावलीले निम्न सामग्री समावेश गर्दछ।QIAGEN ले हाम्रो लागि उत्तम सारांश बनाएको छ।निम्न सबै सुख्खा छन्सामान .

प्रवर्धन वक्र
एम्प्लिफिकेशन कर्भले PCR प्रक्रियाको क्रममा बनाइएको वक्रलाई बुझाउँछ, चक्र नम्बरलाई abscissa को रूपमा र वास्तविक-समय फ्लोरोसेन्स तीव्रतालाई प्रतिक्रियाको रूपमा ordinate को रूपमा जनाउँछ।

एक उत्कृष्ट प्रवर्धन वक्र निम्न विशेषताहरु हुनुपर्छ: आधार रेखा समतल वा थोरै घटेको छ, र त्यहाँ कुनै स्पष्ट माथिको प्रवृत्ति छैन;वक्रको इन्फ्लेक्शन बिन्दु स्पष्ट छ, र घातीय चरणको ढलान प्रवर्धन दक्षताको लागि समानुपातिक छ।ठूलो ढलान, उच्च प्रवर्धन दक्षता;समग्र प्रवर्द्धन वक्र समानान्तर राम्रो छ, प्रत्येक ट्यूबको प्रवर्धन दक्षता समान छ भनेर संकेत गर्दछ;कम एकाग्रता नमूनाहरूको प्रवर्धन वक्रको घातीय चरण स्पष्ट छ।

आधार रेखा (आधार रेखा)
आधारभूत प्रारम्भिक चक्रको आवाज स्तर हो, सामान्यतया 3rd र 15 औं चक्र बीच मापन गरिन्छ, किनभने एम्प्लीफिकेशन उत्पादनको कारणले फ्लोरोसेन्स मूल्य वृद्धि यस अवधिमा पत्ता लगाउन सकिँदैन।आधार रेखा गणना गर्न प्रयोग हुने चक्रहरूको संख्या फरक हुन सक्छ र यदि उच्च टेम्प्लेट मात्राहरू प्रयोग गरिन्छ वा यदि लक्ष्य जीनको अभिव्यक्ति स्तर उच्च छ भने कम गर्न आवश्यक हुन सक्छ।

आधाररेखा सेट गर्नको लागि रैखिकता प्रवर्द्धन वक्रबाट प्रतिदीप्ति डेटा हेर्न आवश्यक छ।आधाररेखा सेट गरिएको छ ताकि एम्प्लीफिकेशन वक्रको वृद्धि आधार रेखा चक्र शीर्ष संख्या भन्दा ठूलो चक्र नम्बरबाट सुरु हुन्छ।प्रत्येक लक्ष्य अनुक्रमको लागि आधार रेखाहरू व्यक्तिगत रूपमा सेट गर्न आवश्यक छ।प्रारम्भिक चक्रहरूमा पत्ता लगाइएको औसत फ्लोरोसेन्स मानहरूलाई एम्प्लीफाइड उत्पादनहरूमा प्राप्त फ्लोरोसेन्स मानहरूबाट घटाउन आवश्यक छ।विभिन्न वास्तविक-समय PCR सफ्टवेयरको नवीनतम संस्करणहरूले व्यक्तिगत नमूनाहरूको लागि आधारभूत सेटिङहरूको स्वचालित अनुकूलनलाई अनुमति दिन्छ।

PCR प्रवर्धन प्रतिक्रिया को पहिलो केहि चक्र को समयमा, प्रतिदीप्ति संकेत धेरै परिवर्तन गर्दैन।सीधा रेखामा पुग्नलाई आधार रेखा भनिन्छ, तर यदि हामीले सुरुका केही चक्रहरूलाई नजिकबाट हेर्‍यौं भने, हामी तलको चित्रमा के भइरहेको छ भन्ने आधार रेखा भित्रै देख्छौं।

पृष्ठभूमि पृष्ठभूमिलाई जनाउँछ
प्रतिक्रियामा गैर-विशिष्ट प्रतिदीप्ति मान।उदाहरणका लागि: अकुशल प्रतिदीप्ति शमन;वा SYBR ग्रीनको प्रयोगको कारणले ठूलो संख्यामा डबल-स्ट्र्यान्डेड DNA टेम्प्लेटहरू।सिग्नलको पृष्ठभूमि कम्पोनेन्टहरू वास्तविक-समय PCR सफ्टवेयर एल्गोरिदमद्वारा गणितीय रूपमा हटाइन्छ।

रिपोर्टर संकेत
रिपोर्टर सिग्नलले वास्तविक-समय PCR को समयमा SYBR ग्रीन वा फ्लोरोसेन्ट रूपमा लेबल गरिएको अनुक्रम-विशेष प्रोबहरू द्वारा उत्पन्न फ्लोरोसेन्ट संकेतलाई जनाउँछ।

सामान्यीकृत रिपोर्टर सिग्नल (RN)
RN ले प्रत्येक चक्रमा मापन गरिएको निष्क्रिय सन्दर्भ डाईको फ्लोरोसेन्स तीव्रताद्वारा विभाजित रिपोर्टर डाईको फ्लोरोसेन्स तीव्रतालाई जनाउँछ।

निष्क्रिय सन्दर्भ डाई
केहि वास्तविक-समय PCR मा,फ्लोरोसेन्ट डाई ROX फ्लोरोसेन्ट संकेतलाई सामान्य बनाउन आन्तरिक सन्दर्भको रूपमा प्रयोग गरिन्छ।।यो गलत पाइपिङ, राम्रो स्थिति, र राम्रो-द्वारा-वेल आधारमा फ्लोरोसेन्स उतार-चढ़ावको कारण भिन्नताहरूको लागि सुधार गर्दछ।

प्रतिदीप्ति थ्रेसहोल्ड (थ्रेसहोल्ड)
ब्याकग्राउन्ड मान भन्दा माथि र एम्प्लीफिकेशन कर्भको पठार मान भन्दा धेरै तल समायोजन गरिएको थियो।यो PCR पत्ता लगाउने लग-रैखिक दायरा प्रतिनिधित्व गर्दै, एम्प्लीफिकेशन कर्भको रेखीय क्षेत्रमा अवस्थित हुनुपर्छ।थ्रेसहोल्डहरू लग-प्रवर्द्धन कर्भ दृश्यमा सेट गरिनु पर्छ ताकि PCR को लग-रैखिक चरण सजिलै पहिचान गर्न सकिन्छ।यदि वास्तविक-समय PCR मा धेरै लक्ष्य जीनहरू छन् भने, प्रत्येक लक्ष्यको लागि थ्रेसहोल्ड सेट हुनुपर्छ।सामान्यतया, PCR प्रतिक्रियाको पहिलो 15 चक्रहरूको प्रतिदीप्ति संकेतलाई प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि संकेतको रूपमा प्रयोग गरिन्छ, र प्रतिदीप्ति थ्रेसहोल्ड PCR को पहिलो 3 देखि 15 चक्रहरूको प्रतिदीप्ति संकेतको मानक विचलनको 10 गुणा हो, र प्रतिदीप्ति थ्रेसहोल्ड PCR को एक्सपोनेन्टल चरणमा सेट गरिएको छ।सामान्यतया, प्रत्येक उपकरणको प्रयोग गर्नु अघि यसको फ्लोरोसेन्स थ्रेसहोल्ड सेट हुन्छ।

साइकल थ्रेसहोल्ड (CT) वा क्रसिङ प्वाइन्ट (CP)
चक्र जसमा एम्प्लीफिकेशन कर्भले थ्रेसहोल्ड पार गर्छ (अर्थात्, प्रतिदीप्ति पत्ता लगाउने बिन्दुमा उल्लेखनीय वृद्धि हुन्छ)।CT एक अंश हुन सक्छ र सुरु टेम्प्लेटको मात्रा गणना गर्न सकिन्छ।CT मानले प्रत्येक PCR प्रतिक्रिया ट्यूबमा फ्लोरोसेन्ट सिग्नल सेट थ्रेसहोल्डमा पुग्दा अनुभव भएका चक्रहरूको संख्या प्रतिनिधित्व गर्दछ।त्यहाँ प्रत्येक टेम्प्लेटको CT मान र टेम्प्लेटको प्रारम्भिक प्रतिलिपि नम्बरको लगरिथम बीच एक रैखिक सम्बन्ध छ,प्रारम्भिक प्रतिलिपि संख्या उच्च, CT मान सानो, र यसको विपरित।एक मानक वक्र ज्ञात प्रारम्भिक प्रतिलिपि नम्बरको साथ मानक प्रयोग गरेर बनाउन सकिन्छ, जहाँ abscissa ले CT मानलाई प्रतिनिधित्व गर्दछ, र ordinate ले प्रारम्भिक प्रतिलिपि नम्बरको लगरिथम प्रतिनिधित्व गर्दछ।त्यसकारण, जबसम्म अज्ञात नमूनाको CT मान प्राप्त हुन्छ, नमूनाको प्रारम्भिक प्रतिलिपि नम्बर मानक वक्रबाट गणना गर्न सकिन्छ।

ΔCT मान
ΔCT मान वर्णन गर्दछलक्षित जीन र सम्बन्धित अंतर्जात सन्दर्भ जीन CT मान बीचको भिन्नता, जस्तै हाउसकीपिङ जीन, र प्रयोग गरिएको टेम्प्लेटको मात्रालाई सामान्य बनाउन प्रयोग गरिन्छ:
⇒ΔCT = CT (लक्ष्य जीन) - CT (अन्तर्भुज सन्दर्भ जीन)

ΔΔCT मान
ΔΔCT मानले रुचिको नमूनाको औसत ΔΔCT मान (जस्तै, उत्तेजित कक्षहरू) र सन्दर्भ नमूनाको औसत ΔΔCT मान (जस्तै, असुरक्षित कक्षहरू) बीचको भिन्नता वर्णन गर्दछ।सन्दर्भ नमूनालाई क्यालिब्रेसन नमूना पनि भनिन्छ र अन्य सबै नमूनाहरू सापेक्ष परिमाणीकरणको लागि सामान्यीकृत हुन्छन्:
⇒ΔΔCT = औसत ΔCT (चासोको नमूना) - औसत ΔCT (संदर्भ नमूना)

अन्तर्जात सन्दर्भ जीन (अन्तर्जनिय सन्दर्भ जीन)
अन्तर्जात सन्दर्भ जीनहरूको अभिव्यक्ति स्तरहरू, जस्तै हाउसकीपिङ जीनहरू (हाउसकीपिङ जीन), नमूनाहरू बीच फरक हुँदैन।सन्दर्भ जीनको CT मानहरूलाई लक्षित जीनसँग तुलना गर्नाले लक्ष्य जीनको अभिव्यक्ति स्तरलाई इनपुट RNA वा cDNA को मात्रामा सामान्यीकरण गर्न अनुमति दिन्छ (माथिको ΔCT मानहरूमा खण्ड हेर्नुहोस्)।

आन्तरिक सन्दर्भ जीनहरूको लागि सहीसम्भावित आरएनए गिरावट वा आरएनए नमूनाहरूमा इन्जाइम अवरोधकहरूको उपस्थिति, साथै आरएनए सामग्रीमा भिन्नता, रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन दक्षता, न्यूक्लिक एसिड रिकभरी, र नमूना ह्यान्डलिङ।इष्टतम सन्दर्भ जीन (हरू) चयन गर्न, हामीले प्रयोगात्मक सेटिङमा निर्भर इष्टतम सन्दर्भको चयनलाई अनुमति दिनको लागि एल्गोरिदम परिमार्जन गर्यौं।

आन्तरिक नियन्त्रण
एउटा नियन्त्रण अनुक्रम जुन लक्ष्य अनुक्रमको रूपमा एउटै प्रतिक्रियामा एम्प्लीफाइड हुन्छ र फरक प्रोब (जस्तै, डुप्लेक्स PCR प्रदर्शन गर्दै)।आन्तरिक नियन्त्रणहरू प्राय: असफल एम्प्लीफिकेशनहरू अस्वीकार गर्न प्रयोग गरिन्छ, जस्तै जब लक्ष्य अनुक्रम पत्ता लाग्दैन।
क्यालिब्रेसन नमूना
एउटा सन्दर्भ नमूना (उदाहरणका लागि, सेल लाइन वा टिश्यूबाट शुद्ध गरिएको आरएनए) सापेक्ष मात्रामा प्रयोग गरिन्छ जुन अन्य सबै नमूनाहरू तुलना गर्नको लागि जीनको सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर निर्धारण गर्न।क्यालिब्रेसन नमूना कुनै पनि नमूना हुन सक्छ, तर सामान्यतया नियन्त्रण हो (उदाहरणका लागि, उपचार नगरिएको नमूना वा प्रयोगको समय शून्यबाट नमूना)।

सकारात्मक नियन्त्रणहरू
नियन्त्रण प्रतिक्रियाहरू प्रयोग गर्नुहोस्टेम्प्लेट को ज्ञात मात्रा।सकारात्मक नियन्त्रणहरू प्राय: प्राइमर सेट वा प्राइमर-प्रोब सेट ठीकसँग काम गरिरहेको छ र प्रतिक्रिया सही रूपमा सेट अप गरिएको छ भनेर जाँच गर्न प्रयोग गरिन्छ।

टेम्प्लेट नियन्त्रण छैन (NTC)
एउटा नियन्त्रण प्रतिक्रिया जसमा टेम्प्लेट बाहेक एम्प्लीफिकेशन प्रतिक्रियाका सबै आवश्यक अवयवहरू समावेश हुन्छन्, जुन सामान्यतया पानीले बदलिन्छ।NTC को प्रयोगले अभिकर्मक संदूषण वा विदेशी DNA को कारण हुने प्रदूषण पत्ता लगाउन सक्छ, यसरी पत्ता लगाउने डाटाको प्रामाणिकता र विश्वसनीयता सुनिश्चित गर्दछ।NTC नियन्त्रणको प्रवर्धनले प्रदूषणलाई संकेत गर्दछ।

RT नियन्त्रण छैन (NRT)
आरएनए निकासी प्रक्रियामा अवशिष्ट जीनोमिक डीएनए समावेश हुन सक्छ, जुन अत्यन्त हानिकारक छ र डाटाको गुणस्तरलाई असर गर्ने अपराधी हो र qPCR को प्राकृतिक शत्रु हो, त्यसैले प्रयोगहरू डिजाइन गर्दा, यो आरएनए पत्ता लगाउने मात्र विस्तार गर्न डिजाइन गरिएको हुनुपर्छ।त्यहाँ दुईवटा तरिकाहरू छन्, एउटा भित्री भागहरूमा प्राइमरहरू डिजाइन गर्ने, अर्को DNA पूर्ण रूपमा हटाउने, कुन राम्रो हो, जसको पछि छलफल गरिनेछ।NTR नियन्त्रण DNA प्रदूषण पत्ता लगाउन एक जादुई ऐना हो।यदि त्यहाँ प्रवर्धन छ भने, यसको मतलब त्यहाँ प्रदूषण छ।

मानकहरू
मानकहरू ज्ञात एकाग्रता वा प्रतिलिपि नम्बरका नमूनाहरू हुन् जुन मानक वक्र निर्माण गर्न प्रयोग गरिन्छ।मानकको स्थिरता सुनिश्चित गर्न, जीन टुक्रा सामान्यतया प्लाज्मिडमा क्लोन गरिन्छ र मानकको रूपमा प्रयोग गरिन्छ।

मानक वक्र
सामान्यतया दोब्बर अनुपात अनुसार मानक उत्पादनको साथ कम्तिमा 5 एकाग्रता ढाँचामा पातलो गरिन्छ, र CT मान र प्रतिलिपि नम्बरको समन्वयमा 5 बिन्दुहरू कोरिन्छन्, र बिन्दुहरू एक मानक वक्र उत्पन्न गर्न रेखा बनाउन जोडिएका हुन्छन्।प्रत्येक मानक वक्रको लागि, यसको वैधता जाँच गर्न आवश्यक छ।ढलान मान -3.3 र -3.8 को बीचमा पर्दछ, र प्रत्येक एकाग्रता ट्रिपलिकेटमा प्रदर्शन गरिन्छ।अन्य बिन्दुहरु भन्दा उल्लेखनीय रूपमा भिन्न अंकहरू खारेज गर्नुपर्छ।परीक्षण गरिने नमूनाको CT मानलाई मानक वक्रमा ल्याइएको छ, र परीक्षण गरिने नमूनाको अभिव्यक्ति स्तर गणना गर्न सकिन्छ।

परीक्षण गरिने नमूनाको CT मानलाई मानक वक्रमा ल्याइएको छ, र परीक्षण गरिने नमूनाको प्रारम्भिक प्रतिलिपि नम्बर गणना गर्न सकिन्छ।

दक्षता र ढलान
मानक वक्र को ढलान वास्तविक समय PCR को दक्षता को प्रतिनिधित्व गर्दछ।
-३.३२२ को ढलानले PCR प्रवर्द्धन दक्षता 1, वा 100% कुशल छ, र PCR उत्पादनको मात्रा प्रत्येक चक्रमा दोब्बर हुन्छ भनेर संकेत गर्छ।
-३.३२२ भन्दा कम ढलान (जस्तै -३.८) ले पीसीआर दक्षतालाई जनाउँछ
· –३.३२२ भन्दा ठुलो ढलान (जस्तै –३.०) ले पीसीआर दक्षता १००% भन्दा बढी रहेको देखाउँछ, जुन जिज्ञासाको कुरा हो, कसरी पीसीआरको एउटा चक्रले एम्प्लीफाइड उत्पादनलाई दोब्बरभन्दा बढी उत्पादन गर्न सक्छ?यो अवस्था पीसीआर प्रतिक्रियाको गैर-रैखिक चरणमा हुन्छ, अर्थात्, त्यहाँ ठूलो मात्रामा गैर-विशिष्ट प्रवर्धन हुन्छ।

पग्लने वक्र
qPCR प्रवर्धन पूरा भएपछि, PCR उत्पादन तताइएको छ।तापक्रम बढ्दै जाँदा, डबल-स्ट्र्यान्ड एम्प्लीफिकेशन उत्पादन बिस्तारै पग्लन्छ, फलस्वरूप फ्लोरोसेन्स तीव्रतामा कमी आउँछ।जब एक निश्चित तापमान (Tm) पुग्छ, उत्पादनहरूको ठूलो संख्या पग्लिनेछ।फ्लोरोसेन्स तीव्र रूपमा घट्छ।विभिन्न PCR उत्पादनहरूमा विभिन्न Tm मानहरू र फरक पग्लने तापक्रमहरू हुन्छन्, जसले गर्दा PCR को विशिष्टता पहिचान गर्न सकिन्छ।

पिघलने वक्र (व्युत्पन्न वक्र)
पिघलने वक्र शिखर नक्सा बनाउनको लागि व्युत्पन्न गरिएको छ, जसले PCR उत्पादन टुक्राहरूको स्थितिलाई सहज रूपमा प्रदर्शन गर्न सक्छ।पग्लने तापक्रम DNA टुक्राको Tm मान भएको हुनाले, DNA खण्डको Tm मानलाई असर गर्ने केही प्यारामिटरहरूलाई न्याय गर्न सकिन्छ, जस्तै टुक्राको आकार, GC सामग्री, इत्यादि। सामान्यतया हाम्रो प्राइमर डिजाइन सिद्धान्तहरू अनुसार,एम्प्लीफाइड उत्पादनको लम्बाइ 80-300bp को दायरामा छ, त्यसैले पग्लने तापमान 80°C र 90°C को बीचमा हुनुपर्छ।

पिघलने वक्र को व्याख्या: यदि केवल मुख्य शिखर 80°C-90°C को बीचमा देखिन्छ भने, यसको मतलब फ्लोरोसेन्ट मात्रात्मक PCR उत्तम छ;यदि मुख्य चुचुरो 80°C-90°C को बीचमा देखिन्छ र विविध चुचुराहरू 80°C भन्दा कम देखिन्छ भने, प्राइमर डाइमरलाई मूल रूपमा मानिन्छ।तपाईं यसलाई समाधान गर्न annealing तापमान वृद्धि गर्न प्रयास गर्न सक्नुहुन्छ;यदि मुख्य चुचुरो 80°C-90°C को बीचमा देखिन्छ, र तापक्रम बढ्दा विविध चुचुरा फेरि देखा पर्यो भने, यो मूलतः DNA दूषित भएको मानिन्छ, र DNA प्रयोगको प्रारम्भिक चरणमा हटाउन आवश्यक छ।

निस्सन्देह, त्यहाँ अझै पनि केहि असामान्य अवस्थाहरू छन्, जसलाई तल एक एक गरेर टुक्राइनेछ।
3. उन्नत ज्ञान

qPCR गर्न, मैले MIQE भन्नु पर्छ,न्यूनतम जानकारीको प्रकाशन को लागीमात्रात्मकवास्तविक समय पीसीआरप्रयोगहरू - वास्तविक-समय मात्रात्मक PCR बारे लेख प्रकाशित गर्नको लागि न्यूनतम जानकारीप्रयोगहरूसबैको बुझाइलाई सरल बनाउनको लागि, हामी मुख्य सामग्रीलाई सरल बनाउनेछौं।

तपाईले इन्टरनेटमा MIQE को मूल पाठ खोज्न सक्नुहुन्छ, र सबैभन्दा महत्त्वपूर्ण कुरा यो हो कि यसलेलेख प्रकाशित गर्दा उपलब्ध गराउनुपर्ने डाटा चेकलिस्ट .

समीक्षकहरूले यी विवरणहरू पढेर प्रयोगको गुणस्तरको न्याय गर्न सक्छन्;भविष्यका पाठकहरूले पनि प्रयोग दोहोर्याउन वा सुधार गर्न प्रयोग गर्न सक्छन्।
यो नोट गर्न लायक छ कि यस सूचीमा, प्रत्येक सूचीको महत्व क्रमशः E वा D द्वारा चिन्ह लगाइएको छ।यसको मतलब के हो?E: आवश्यक जानकारी (पेश गर्नुपर्छ);D: वांछनीय जानकारी (सकेसम्म प्रदान गर्नुहोस्)।

MIQE (1) - प्रयोगात्मक डिजाइन
धेरै स्कम्ब्यागहरू जसले आफ्नो स्नातक अध्ययन पूरा गरेपछि आफ्नो रक्षा पूरा गरेका छन् उनीहरूले स्वतन्त्र रूपमा प्रयोग कसरी डिजाइन गर्ने, आफ्नो नोटबुक खोल्ने, र शिक्षकले उनीहरूलाई के गर्न भनेका छन् भनेर थाहा हुँदैन।नतिजाको रूपमा, प्रयोगात्मक डिजाइन कठोर थिएन, र पत्रिकाको सम्पादकीय विभागले भन्यो कि तिनीहरू यो चित्र र त्यो चित्र बनाउन चाहन्थे, त्यसैले तिनीहरूले चकित मा गरे।यसरी बनाइन्छ बदमासहरु !

घरको नजिक, प्रयोगको पहिलो सिद्धान्त निर्धारण गर्न होप्रयोगात्मक तर्कको कठोरता।सबैभन्दा आधारभूत कुरा प्रयोगात्मक डिजाइन हो, र प्रयोगात्मक डिजाइनको बारेमा सबैभन्दा महत्त्वपूर्ण कुरा लक्ष्य नमूना, सन्दर्भ नमूना (नियन्त्रण), र पुनरावृत्तिहरूको संख्या कसरी सेट गर्ने भन्ने हो, ताकि प्रयोगात्मक डेटालाई सन्दर्भ, तुलनायोग्य, र विश्वस्त बनाउन सकिन्छ।

लक्ष्य नमूनाएउटा निश्चित उपचार पछि लक्षित जीन पत्ता लगाउन आवश्यक पर्ने नमूनालाई जनाउँछ।सन्दर्भ नमूनाकुनै उपचार बिनाको नमूना हो, जसलाई जीवविज्ञानमा जंगली प्रकार भनिन्छ।

प्रयोगात्मक प्रतिकृतिहरूधेरै महत्त्वपूर्ण छन्।सामान्यतया, प्रेरक प्रतिकृतिहरूको संख्या तीन भन्दा बढी हुनुपर्छ।जैविक प्रतिकृति के हो र प्राविधिक प्रतिकृति के हो भनेर छुट्याउन आवश्यक छ।

जैविक प्रतिकृतिहरू: एउटै प्रमाणिकरण प्रयोग विभिन्न सामग्री (समय, बिरुवा, ब्याच, प्रतिक्रिया प्लेट) संग गरिएको छ।

जैविक नक्कल
उदाहरणको रूपमा काली मिर्चको कीटनाशक उपचारलाई लिऔं।हामी एबीसीका तीनवटा बिरुवामा कीटनाशक स्प्रे गर्न चाहन्छौं, त्यसपछि एबीसीका तीनवटा बिरुवाहरू तीनवटा जैविक प्रतिकृतिहरू हुन्, र तिनीहरू फरक-फरक सामग्रीहरूद्वारा गरिएको एउटै प्रमाणिकरण प्रयोग हुन्।तर एक प्रयोगको रूपमा, एक नियन्त्रण निश्चित रूपमा आवश्यक छ, त्यसैले हामी बिरुवा A को प्रयोगात्मक समूह बनाउनको लागि बिरुवा A को शाखाहरू मध्ये एक स्प्रे गर्न सक्छौं, र नियन्त्रण समूह बनाउनको लागि बिरुवा A को अन्य शाखाहरू स्प्रे गर्न सक्दैनौं।B र C को लागि पनि त्यस्तै गर्नुहोस्।

प्राविधिक प्रतिकृतिहरू (प्राविधिक प्रतिकृतिहरू): यो एक दोहोर्याइएको प्रयोग हो जुन अपरेशनको कारणले गर्दा त्रुटिहरूबाट बच्न डिजाइन गरिएको हो, जुन वास्तवमा एउटै सामग्रीमा समावेश गरिएको डुप्लिकेट प्वाल हो।दुबै उपचार र नियन्त्रणहरूमा लक्षित जीन र आन्तरिक सन्दर्भ जीनको प्रतिकृति सेटिङहरू (न्यूनतम तीन) हुनुपर्छ।

प्राविधिक पुनरावृत्ति
फेरि उदाहरणको रूपमा कीटनाशकसँग उपचार गरिएको काली मिर्चलाई लिनुहोस्।प्लान्ट ए को प्रयोगात्मक समूहको लागि, हामीले यसको लक्षित जीन र आन्तरिक सन्दर्भ जीनको लागि क्रमशः 1, 2, र 3 को तीनवटा PCR प्वालहरू बनायौं, ताकि पत्ता लगाए पछि औसत लिन सकिन्छ।बिरुवाको नियन्त्रणका लागि ए समूहलाई पनि त्यस्तै व्यवहार गरिन्छ।त्यसै गरी बी र सी बिरुवाहरूको लागि समान उपचार गर्नुहोस्।यो प्राविधिक पुनरावृत्ति हो।

यो ध्यान दिन लायक छतथ्याङ्कमा प्रवेश गर्ने कुरा जैविक पुनरावृत्ति हो, र प्राविधिक पुनरावृत्ति भनेको प्रयोगात्मक प्रक्रियामा कुनै अनियमित घटनाहरू छन् कि छैनन् भनी परीक्षण गर्नु हो, जसले गर्दा प्रयोगात्मक नतिजाहरूलाई विश्वसनीय बनाउनको लागि, अर्थात् हामीले प्रायः भनौं भने तिनीहरूको औसत लिएर त्रुटिहरूबाट बच्न।

नकारात्मक नियन्त्रणहरू - NTC र NRT
NTC (नो-टेम्प्लेट नियन्त्रण), टेम्प्लेट बिनाको नियन्त्रण, प्रयोगात्मक सामग्री दूषित छ कि छैन भनेर प्रमाणित गर्न प्रयोग गरिन्छ।सामान्यतया, पानी टेम्प्लेटको रूपमा प्रयोग गरिन्छ।यदि फ्लोरोसेन्ट प्रतिक्रिया छ भने, यसले प्रयोगशालामा न्यूक्लिक एसिड प्रदूषण भएको संकेत गर्दछ।

यी प्रदूषणहरूबाट आउँछन्: अशुद्ध पानी, अन्तर्जात DNA युक्त अयोग्य अभिकर्मकहरू, प्राइमर प्रदूषण, प्रयोगशाला उपकरण प्रदूषण, एरोसोल प्रदूषण, आदि, RNase स्क्याभेन्जरहरू र RNase अवरोधकहरू प्रयोग गर्न आवश्यक छ।एरोसोल प्रदूषण पत्ता लगाउन सबैभन्दा गाह्रो छ।कल्पना गर्नुहोस् कि तपाईंको प्रयोगशाला धुवाँ जस्तै छ, विभिन्न न्यूक्लिक एसिडहरू हावामा निलम्बित छन्।

NRT (नो-रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेज), रिभर्स ट्रान्सक्रिप्सन बिनाको नियन्त्रण, नकारात्मक नियन्त्रणको रूपमा गैर-रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन गरिएको RNA हो, जुन gDNA अवशेषहरूको नियन्त्रण हो।

जीन अभिव्यक्ति गर्दा, रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन पछि सीडीएनए को मात्रा पत्ता लगाएर आरएनए को मात्रा पत्ता लगाइन्छ।यदि आरएनए शुद्ध हुँदा gDNA अवशेषहरू छन् भने, यसले प्रयोगात्मक परिणामहरूमा त्रुटिहरू निम्त्याउनेछ, किनभने वास्तविक परिणामहरू gDNA र cDNA हुन्।समग्र स्तरमा, सीडीएनए मात्र होइन, आरएनए निकासीको क्रममा जीडीएनए पूर्ण रूपमा हटाउन आवश्यक छ।

MIQE (2) - नमूना जानकारी
तथाकथित नमूना जानकारीको अर्थ हो कि जब हामीले qPCR को बारेमा लेख प्रकाशित गर्छौं, हामीले नमूना जानकारी स्पष्ट रूपमा व्याख्या गर्नुपर्छ, जुन लेखको अपरिहार्य अंश हो।त्यसै गरी, जब हामी नमूनाहरू प्रशोधन गर्छौं, हामीले नमूनाहरूको वैधता सुनिश्चित गर्न आफ्नै सञ्चालनहरू पनि विनियमित गर्नुपर्छ।

नमूनाको विवरण केवल एक परिणाम हो, र हामीले सम्पूर्ण प्रयोगको क्रममा लिइएका सामग्रीहरूमा बढी ध्यान दिनुपर्छ।

प्रयोगात्मक सामग्री को चयन
रगत नमूनाहरू - ताजा रगत छान्नुहोस्, 4 घण्टा भन्दा बढी।सेल नमूनाहरू - बलियो वृद्धिको अवधिमा ताजा कोशिकाहरू सङ्कलन गर्न छनौट गर्नुहोस्।पशु टिस्यु - ताजा, जोसिलो बढ्दो टिस्यु छान्नुहोस्।बिरुवाको टिस्यु - ताजा, जवान टिस्यु छान्नुहोस्।

तपाईंले याद गर्नु भएको छ कि यी केहि वाक्यहरूमा एक प्रमुख शब्द छ: ताजा।
माथिका नमूनाहरूको लागि, बजारमा सबैभन्दा राम्रो, लागत-प्रभावी र स्थिर किट फोरेजिनको किट हो, जसले उनीहरूको DNA र RNA छिटो र सजिलै निकाल्न सक्छ।

ब्लड डीएनए मिनी किट

सेल कुल आरएनए अलगाव किट

पशु कुल आरएनए अलगाव किट

प्लान्ट टोटल आरएनए आइसोलेशन किट

प्लान्ट टोटल आरएनए आइसोलेशन किट प्लस

प्लान्ट डीएनए आइसोलेशन किट

प्रयोगात्मक सामग्रीको भण्डारण
सामान्यतया, हामी नमूनाहरू भण्डारण गर्न सिफारिस गर्दैनौं, यदि परिस्थितिले अनुमति दिन्छ।यद्यपि, त्यहाँ धेरै साथीहरू छन् जसले नमूना लिएको तुरुन्तै प्रयोग गर्न सक्दैनन्, र कतिपयले नमूनाको लागि तरल नाइट्रोजन ट्याङ्कीहरू फिल्डमा लैजानुपर्छ।

यस प्रकारको मेहनती साथीको लागि, म मात्र भन्न सक्छु कि तपाईले अभिकर्मक उपभोग्य वस्तुहरू बुझ्नुहुन्न।अब धेरै अभिकर्मक उपभोग्य कम्पनीहरूले अभिकर्मकहरू उत्पादन गर्छन् जसले कोठाको तापक्रममा आरएनए नमूनाहरू भण्डारण गर्न सक्छन्, र तपाईंले तिनीहरूलाई प्रयोग गर्न रोज्न सक्नुहुन्छ।पारम्परिक भण्डारण विधि भनेको तरल नाइट्रोजन भण्डारण हो, सानो तरल नाइट्रोजन ट्याङ्की प्रयोग गरी बोक्न सजिलो हुन्छ।नमूनालाई प्रयोगशालामा फिर्ता ल्याएपछि, यसलाई -80 डिग्री सेल्सियस फ्रिजमा भण्डार गर्नुहोस्।

आरएनए समावेश प्रयोगहरूको लागि, छ-शब्द सिद्धान्त पालना गर्नुपर्छ:कम तापमान, कुनै इन्जाइमहरू,रछिटो .

कम तापमान को अवधारणा बुझ्न सजिलो छ;इन्जाइमहरू बिना, RNase हामी बस्ने संसारमा जताततै छ (अन्यथा तपाईं एचआईभीले मार्नुहुने थियो), त्यसैले प्रयोग गर्दा RNase कसरी बच्ने एक धेरै महत्त्वपूर्ण अवधारणा हो;छिटो,संसारमा कुनै कुङ्ग फु छैन जसलाई तोड्न सकिदैन, केवल गतिलाई तोड्न सकिदैन।

तसर्थ, एक अर्थमा, निकासी समय छोटो, किट राम्रो।किन गर्छफोरेजीनको किटले गतिलाई जोड दिन्छ, किनकि उनीहरूलाई यो राम्रोसँग थाहा छ।

PS: केही केटीहरूले धेरै सावधानीपूर्वक प्रयोगहरू गर्छन्, तर तिनीहरू धेरै वर्षको काम पछि स्ल्याम डंक जत्तिकै राम्रो हुँदैनन्।उनीहरूलाई लाग्छ कि परमेश्वर अन्याय हुनुहुन्छ, अरूको बारेमा गुनासो गर्दै र जीवन खोज्दै हुनुहुन्छ।वास्तवमा, उनले यो बुझेनन्।उसले आरएनएलाई राम्रोसँग जोगाउन सकेन, र स्ल्याम डङ्क प्लेयर फुर्तिलो थियो।जब उनी प्रयोग गर्दै थिए, उसले सोचेको थियो कि उसले स्ल्याम डङ्कलाई तीन पटक, पाँच पटक र दुईवटा डिभिजन गरेर पूरा गर्नेछ, तर उनले प्रयोग राम्रोसँग गरे।

नोट: ढिलो, RNase आक्रमणको अधिक संभावना।कसरी छिटो हुन आफैलाई तालिम दिने?त्यहाँ कुनै उपाय छैन, केवल अधिक अभ्यास गर्नुहोस्।

विभिन्न प्रयोगहरू र विभिन्न नमूनाहरूको लागि, अझै पनि थप साहित्य पढ्न र प्रशोधनको लागि उपयुक्त विधि छनौट गर्न आवश्यक छ।नमूना सङ्कलन र भण्डारण प्रक्रियाको लागि, MIQE ले यो कागजमा स्पष्ट रूपमा लेखिएको हुनुपर्छ, ताकि समीक्षकहरूले कागजको विश्वसनीयताको समीक्षा गर्न सकून्, र स्तब्ध भएका युवाहरूलाई तपाईंको प्रयोग दोहोर्याउन पनि यो सुविधाजनक हुन्छ।

यद्यपि जैविक प्रयोगहरू कठिन छन्, तिनीहरू उच्च-अन्त हुन्।यदि तपाईं सावधान हुनुहुन्न भने, तपाईं संसारलाई उल्ट्याउन सक्नुहुन्छ।उदाहरणका लागि, सार्सलाई बायोकेमिकल संकटमा पार्ने, वा १.३ बिलियन मानिसहरूलाई बचाउन हाइब्रिड चामल बनाउने।तलको तस्बिर एक रासायनिक प्रयोग हो, तपाईले बुझ्नु पर्छ कि तपाई आफ्नो अनुसन्धानमा कति गर्व गर्नुहुन्छ केवल उसको डिक जस्तो उपस्थिति हेरेर।यसलाई बिर्सनुहोस्, उसलाई कालो नगर्नुहोस्।

MIQE (3) - न्यूक्लिक एसिड निकासी।
न्यूक्लिक एसिड निकासी एउटा ठूलो घटना हो, र सबै आणविक जीवविज्ञान प्रयोगहरू न्यूक्लिक एसिड निकासीबाट सुरु हुन्छन्।सबैभन्दा पहिले, न्यूक्लिक एसिड निकासीमा MIQE को सामग्री प्रतिलिपि गरौं।

यो फारम हेर्दै, तपाईं सतहमा रहन सक्नुहुन्न।रूप एक सिद्धान्त हो।शीर्ष विद्यार्थी हुनको लागि, तपाईंले किन सोध्नु पर्छ।यस तालिकाको आवश्यक सामग्री हो: अनुसरण गर्नुहोस्RNA को शुद्धता, अखण्डता, स्थिरता र निकासी रकम .

को पहिलो भागप्रक्रिया वा उपकरण न्यूक्लिक एसिड निकासी चरण हो।यदि तपाइँ एक्स्ट्र्याक्ट गर्न स्वचालित न्यूक्लिक एसिड एक्स्ट्रक्टर प्रयोग गर्नुहुन्छ (उन्नत, कृपया खरीदको लागि मलाई सम्पर्क गर्नुहोस्), तपाइँले उपकरणको मोडेल नाम संकेत गर्न आवश्यक छ।

किटको नाम र

परिवर्तन विवरणहरूका लागि कुन किट प्रयोग गरिएको थियो, कुन विशेष अभिकर्मकहरू थपिएका थिए वा कुन विशेष अपरेशनहरू गरिएका थिए स्पष्ट रूपमा व्याख्या गरिनु पर्छ ताकि अरूले सजिलैसँग तपाइँको प्रयोग दोहोर्याउन सकून्।

केही व्यक्तिहरूले विशेष नमूनाहरू निकाल्दा केही विशेष अभिकर्मकहरू थप्छन्, यो सोचेर कि यो उनीहरूको गोप्य हतियार हो र अरूलाई नभन्नुहोस्।यसलाई गोप्य राख्दा, तिनीहरूले तपाईंको लेखलाई चम्काउने अवसर पनि गुमाउँछन्।चतुर नबन, वैज्ञानिक अनुसन्धानमा देश पुरानो झाङ भन्दा इमान्दार हुनुपर्छ, चतुर बन्न चाहनुहुन्छ भने लेखले मुर्ख बनाउछ ।

किटको उत्पादन नम्बर याद गर्नुपर्छजब तपाइँ किट अर्डर गर्नुहुन्छ र लेख लेख्नुहुन्छ।किटमा सामान्यतया दुई नम्बरहरू हुन्छन्: बिरालो-क्याटलग नम्बर (उत्पादन नम्बर, लेख नम्बर), लट-उत्पादन संख्या (उत्पादन कुन ब्याचबाट आएको हो भनेर संकेत गर्न प्रयोग गरिन्छ)।

थप रूपमा, जैव रासायनिक अभिकर्मकहरू अर्डर गर्दा CAS नम्बर प्रायः प्रयोग गरिन्छ, र म यसलाई सँगै लोकप्रिय बनाउनेछु।CAS नम्बर प्रत्येक नयाँ रासायनिक औषधिलाई अमेरिकी केमिकल सोसाइटीले दिएको नम्बर हो।सामान्यतया, तीनवटा नम्बरहरू ड्यासद्वारा जोडिएका हुन्छन्।Rushui को CAS नम्बर: 7732-18-5।रसायनहरूमा प्राय: धेरै उपनामहरू हुन्छन्, तर CAS नम्बर अद्वितीय हुन्छ।औषधि अर्डर गर्दा, तपाइँ पहिले यसको CAS नम्बर जाँच गर्न सक्नुहुन्छ।

घरको नजिक, हामीले यी चीजहरू किन स्पष्ट रूपमा वर्णन गर्नुपर्छ?वास्तवमा, यो आरएनए निकासीको गुणस्तर जाँच गर्न पनि हो।उपकरण र किटको प्रयोगले आरएनए निकासीलाई थप सुसंगत बनाउनेछ।साधारण प्रयोगशालाहरूको निकासी मापन ठूलो छैन, र यो किट संग प्राप्त गर्न सकिन्छ।

DNase वा RNase उपचारको विवरण
फ्लोरोसेन्ट मात्रात्मक पीसीआरको महत्त्वपूर्ण मुद्दा डीएनए प्रदूषण रोक्न हो, र यदि त्यहाँ प्रदूषण छ भने प्रयोग नगर्नुहोस्।तसर्थ, प्रयोगात्मक प्रक्रियामा डीएनए पूर्ण रूपमा हटाइएको छ भनी देखाउनको लागि तपाईंले DNA प्रशोधन गर्न प्रयोग गर्नुभएको प्रक्रिया बताउन अनिवार्य छ।योजनाबद्ध रेखाचित्र द्वारा प्रतिनिधित्व।

आरएनए र डीएनए को योजनाबद्ध रेखाचित्र
सामान्यतया, DNA हटाउने विधि निकासी पछि DNase संग RNA को उपचार हो।यद्यपि, यी तुलनात्मक रूपमा पुरानो विधिहरू हुन्।वाणिज्य आरएनए निकासी किटहरू DNase थप नगरी निकासी प्रक्रियाको क्रममा DNA हटाउन सक्षम भएका छन्।उदाहरण को लागी, Foregene बाट किट को एक श्रृंखला।

नोट: आरएनए निकासीको क्रममा डीएनए हटाउनु एकदमै खतरनाक दोधारे तरवार हो, जसले आरएनए निकासीको सञ्चालन समयलाई लम्ब्याउँछ र आरएनए क्षयको जोखिम बढाउँछ।मूलतः, यो आरएनए उपज र शुद्धता बीचको व्यापार हो।

थप रूपमा, सिलिका-आधारित सोखन स्तम्भमा थपिएको DNase को मात्रा धेरै सानो छ, र प्रभाव प्राप्त गर्न उच्च-गुणस्तर DNase प्रयोग गर्नुपर्छ।अप्टिमाइज्ड DNase छिटो र पूर्ण रूपमा पचाउन सकिँदैन।यो व्यापारीको प्राविधिक स्तरको परीक्षण हो।निस्सन्देह, त्यहाँ अझ धेरै अनौठो व्यापारीहरू छन् जसले घमण्ड गर्छन् कि DNA बिना DNase हटाउन सकिन्छ।यो भन्न सकिन्छ कि DNase बिना DNA पूर्ण रूपमा हटाउन सकिन्छ भनेर घमण्ड गर्ने जो कोही गुंडा हो।DNA एक अपेक्षाकृत स्थिर दोहोरो-स्ट्रेन्ड संरचना हो, र यो केवल कुरा गरेर र हाँस्दै मेटाउन सकिदैन।

प्रदूषण मूल्याङ्कन
मूल्याङ्कन विधि: इलेक्ट्रोफोरेसिस पत्ता लगाउने, 1% agarose, 6V/cm, 15min, लोड हुँदै 1-3 ul

न्यूक्लिक एसिड मात्रात्मक विश्लेषण
सामान्यतया UV स्पेक्ट्रोफोटोमिटर प्रयोग गरेर मापन गरिन्छ।मलाई पहिले OD260, OD280, र OD230 को तीन मानहरूको अर्थ लोकप्रिय बनाउनुहोस्।
·OD260nm: यो न्यूक्लिक एसिडको उच्चतम अवशोषण शिखरको अवशोषण तरंगदैर्ध्य हो, र सबैभन्दा राम्रो मापन गरिएको मान ०.१ देखि १.० सम्म हुन्छ।यदि होइन भने, दायरा भित्र ल्याउन नमूनालाई पातलो वा केन्द्रित गर्नुहोस्।
·OD280nm: यो प्रोटिन र फेनोलिक पदार्थहरूको उच्चतम अवशोषण शिखरको अवशोषण तरंग लम्बाइ हो।
·OD230nm: यो कार्बोहाइड्रेटको उच्चतम अवशोषण शिखरको अवशोषण तरंगदैर्ध्य हो।

अर्को, प्रत्येक सूचकको भूमिका बारे कुरा गरौं।A260 को लागि, यसलाई न्यूक्लिक एसिडको उपज मापन गर्न प्रयोग गर्न सकिन्छ।जब OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml।

शुद्धताको लागि, हामीले सामान्यतया देख्ने अनुपातहरू हेर्न आवश्यक छ: OD260/280 र OD260/230।
शुद्ध DNA: OD260/280 लगभग 1.8 बराबर छ।१.९ भन्दा बढी हुँदा यसले आरएनए प्रदुषण भएको जनाउँछ र १.६ भन्दा कम हुँदा प्रोटिन र फिनोल प्रदूषण रहेको जनाउँछ।
शुद्ध आरएनए: १.७
·OD260/230: चाहे यो DNA होस् वा RNA, सन्दर्भ मान 2.5 हो।जब यो 2.0 भन्दा कम हुन्छ, यसले चिनी, नुन र जैविक पदार्थको प्रदूषण भएको संकेत गर्दछ।

आरएनए अखण्डता

आरएनए को अखण्डता मापन गर्न यो धेरै महत्त्वपूर्ण छ।सामान्यतया, 28S र 18S RNA बीचको चमक दुई गुणा सम्बन्ध हो कि छैन भनेर जाँच गर्न RNA डिनेच्युरेसन जेल प्रयोग गर्न आवश्यक छ।जब तेस्रो ब्यान्ड 5S देखा पर्दछ, यसको मतलब आरएनए घट्न थालेको छ, इन्भर्टेब्रेट्स बाहेक।

RNA गुणस्तर मूल्याङ्कनका लागि डाटा: माथिका परीक्षणहरूका अतिरिक्त, त्यहाँ केही थप उन्नत उपकरण परीक्षणहरू पनि छन् जुन RNA अखण्डताको सन्दर्भमा, जस्तै एक्सपेरियन स्वचालित इलेक्ट्रोफोरेसिस प्रणालीको RQI अखण्डता परीक्षण, जसले RNA अदृश्य रूपमा घटेको छ कि छैन भनेर पत्ता लगाउन सक्छ।

वैज्ञानिक अनुसन्धानमा, फ्लोरोसेन्ट मात्रात्मक PCR लक्ष्य जीन र आन्तरिक सन्दर्भ जीन बीचको तुलना हो।त्यसकारण, आरएनए नमूना संरक्षण, आरएनए निकासी, आदि को प्रक्रियामा, प्राथमिक लक्ष्य आरएनए को अखण्डता सुनिश्चित गर्नु हो।

आरएनएको अखण्डताले लक्षित जीन र आन्तरिक सन्दर्भ जीन बीचको सन्तुलनलाई कसरी असर गर्छ तलको चित्रबाट सजिलै बुझ्न सकिन्छ।ह्रासले जीन अपूर्णता निम्त्याउँछ, चाहे त्यो आन्तरिक सन्दर्भ जीनको अपूर्णता होस् वा लक्षित जीनको अपूर्णता, यसले डेटामा ठूलो प्रभाव पार्छ।

लक्ष्य जीन र सन्दर्भ जीनको योजनाबद्ध रेखाचित्र, सत्य हुनु हुँदैन

निषेध परीक्षण (चाहे CT मान उच्च वा कम एकाग्रता वा अन्य अवस्थाहरूमा दबाइन्छ)

यो आंकडालाई उदाहरणको रूपमा लिँदा, पाँच वक्रहरूको Ct मानहरू निम्नानुसार छन्।वक्रहरू बीच CT मानहरूको वितरण असमान छ, र Ct मानहरू उच्च र कम एकाग्रता अन्तर्गत ढिलाइ हुन्छन्, जुन PCR अवरोधको मामला हो।

मुख्य बिन्दु: आरएनए निकासीको प्रक्रियामा, हामीले गलत धारणाहरू त्याग्नु पर्छ र सहीहरू स्थापित गर्न आवश्यक छ।

गलत विचार यो हो: आरएनए निकासीले मात्र उपजलाई पछ्याउँछ, यो सोचेर कि जति ठूलो आरएनए प्राप्त हुन्छ, उति राम्रो हुन्छ।वास्तवमा, जब हामी परिमाणीकरण गर्छौं, यदि जीनको संख्या धेरै ठूलो छैन भने, हामीलाई धेरै आरएनए आवश्यक पर्दैन।तपाईंले निकालेको आरएनएको मात्रा पर्याप्त भन्दा बढी छ।

सही अवधारणा हो:आरएनए निकासीले शुद्धता, अखण्डता र स्थिरताको पछि लाग्नुपर्छ।शुद्धताले सुनिश्चित गर्न सक्छ कि पछिको उल्टो ट्रान्सक्रिप्शन रोकिएको छैन र डाटा DNA द्वारा प्रभावित हुनेछैन।अखण्डताले लक्ष्य अनुक्रम र आन्तरिक सन्दर्भहरूको सन्तुलन सुनिश्चित गर्दछ।स्थिरता स्थिर नमूना लोडिङ सुनिश्चित गर्दछ।

MIQE (4) - उल्टो ट्रान्सक्रिप्शन
गलत धारणा: उच्च नमूना मात्रा को खोजी।
सही अवधारणा: स्थिरता (स्थिरता) को पालना गर्नुहोस्, आरएनए लोड गरिएको मात्रालाई ध्यान नदिई, रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शनको दक्षता स्थिर रहन्छ, सुनिश्चित गर्दै कि cDNA मा भिन्नताहरूले वास्तवमा mRNA मा भिन्नताहरू प्रतिबिम्बित गर्न सक्छ।
हामी यो प्रक्रियालाई योजनाबद्ध रेखाचित्रको साथ व्याख्या गर्छौं:

उल्टो ट्रान्सक्रिप्शन दक्षताको योजनाबद्ध रेखाचित्र, सत्य नहुनुहोस्
सबैभन्दा पहिले, हामीले रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन प्रक्रिया र PCR प्रक्रिया बीचको भिन्नता बुझ्न आवश्यक छ।PCR ले धेरै तताउने र annealing प्रक्रियाहरू पार गर्दछ, र लक्ष्य टुक्रा द्रुत रूपमा बढ्छ;जब रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शनमा यो प्रक्रिया हुँदैन, हामी कल्पना गर्न सक्छौं कि रिभर्स ट्रान्सक्रिप्सन वास्तवमा प्रतिकृति प्रक्रियाको क्रममा एक-देखि-एक हुन्छ, आरएनएका धेरै टुक्राहरू

त्यहाँ cDNA जानकारीको धेरै टुक्राहरू प्राप्त गर्न सकिन्छ, यो अहिले सम्म बुझ्नुपर्छ, किनकि ठूला र साना टुक्राहरू उल्टो ट्रान्सक्राइब गरिएको छ, र यो एक टुक्रामा फोकस गर्न असम्भव छ।र RNA को मात्रा अपेक्षाकृत सानो भएकोले, CDNA को मात्रा पनि अपेक्षाकृत सानो छ, PCR को विपरीत, जसमा एम्प्लीफिकेशन प्रभाव छ, त्यसैले यो पत्ता लगाउन असम्भव छ।

सीडीएनए इलेक्ट्रोफोरेसिस परिणाम
दोस्रो, आदर्श रूपमा, रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन एक-देखि-एक प्रदर्शन गरिन्छ, तर कुनै पनि कम्पनीबाट रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेजले यो प्रभाव हासिल गर्न सक्दैन।सामान्यतया, अधिकांश रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेसहरूको दक्षता 30-50% को बीचमा घुम्छ।यदि यो मामला हो भने, हामीसँग तुलनात्मक रूपमा स्थिर रिभर्स ट्रान्सक्रिप्सन दक्षता हुन्छ, जुन हामी चित्रमा हेर्न चाहन्छौं: 3 RNAs ले 2 cDNA पाउँछन्, 6 RNA ले 4 cDNA पाउँछन्, त्यसैले जतिसुकै नमूना लोड भए पनि, रिभर्स ट्रान्सक्रिप्सन दक्षता अपेक्षाकृत स्थिर हुन्छ।हामी स्थिति हेर्न चाहँदैनौं जहाँ रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन दक्षता अस्थिर छ र उच्च एकाग्रता रोकिएको छ।

त्यसोभए, रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन दक्षता स्थिर छ कि छैन भनेर कसरी प्रमाणित गर्ने?विधि धेरै सरल छ, तपाईंले केवल एक तुलनात्मक परीक्षण गर्न आवश्यक छ: एउटा RNA को दोब्बर dilution पछि cDNA मा उल्टो ट्रान्सक्राइब गर्न, र अर्को cDNA मा रिभर्स ट्रान्सक्राइब गरे पछि दोब्बर पातलो बनाउन, र त्यसपछि प्राप्त ढलान हेर्न qPCR गर्न यो अनुरूप छ।शीर्ष विद्यार्थीको रूपमा, तपाईंले यसलाई सेकेन्डमा बुझ्नुपर्छ।तल देखाइएको रूपमा:

रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शनको प्रभावकारिता स्थिर छ कि छैन भनेर परीक्षण गर्न RNA र cDNA को कमजोरी
उल्टो ट्रान्सक्रिप्टेस र किट
कसरी पूर्ण फ्लोरोसेन्ट मात्रात्मक PCR मा उत्कृष्ट रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेज र किट हुन सक्छ।रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेजलाई स्रोत अनुसार दुई प्रकारमा विभाजित गरिएको छ, AMV वाM-MLV, र तिनीहरूको प्रदर्शन तालिकामा देखाइएको जस्तै छ।

RNase एच गतिविधि
RNase H Ribonuclease H हो, चिनियाँ नाम ribonuclease H हो, जुन एक endoribonuclease हो जसले DNA-RNA हाइब्रिड चेनमा RNA लाई विशेष रूपमा हाइड्रोलाइज गर्न सक्छ।RNase H ले एकल-स्ट्र्यान्डेड वा डबल-स्ट्र्यान्डेड DNA वा RNA मा फास्फोडिएस्टर बन्डहरूलाई हाइड्रोलाइज गर्न सक्दैन, अर्थात्, यसले एकल-स्ट्र्यान्डेड वा डबल-स्ट्र्यान्डेड DNA वा RNA पचाउन सक्दैन।सामान्यतया cDNA को दोस्रो स्ट्र्यान्डको संश्लेषणमा प्रयोग गरिन्छ।

अचम्मको कुरा हो।हामी भन्छौं कि रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेसमा RNase H गतिविधि हुन्छ, त्यो होइन कि रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेजले RNase H समावेश गर्दछ, र RNase H लाई रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेजबाट अलग गर्न सम्भव नहुन सक्छ, हुनसक्छ रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेजमा केही समूहहरूको कन्फर्मेसनले गर्दा यो गतिविधि रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेजको कारणले भएको हो।

तसर्थ, AMV को उच्च रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन दक्षताको बाबजुद, यसको RNase H गतिविधिले cDNA को उपज कम गर्छ।निस्सन्देह, अभिकर्मक निर्माताहरूले सीडीएनएको उपज बढाउन सम्भव भएसम्म रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेजमा RNase H गतिविधिलाई हटाउन आफ्ना उत्पादनहरूलाई निरन्तर अनुकूलन गरिरहेका छन्।
एनीलिंग तापमान

विभिन्न तापमानमा RNA को माध्यमिक संरचना
फरक तापक्रममा RNA को माध्यमिक संरचनाको लागि माथिको चित्र हेर्नुहोस्, र विशिष्ट तापमान र नुन एकाग्रता अवस्थाहरूमा लक्षित टुक्राको माध्यमिक संरचना निर्धारण गर्न mFold अनलाइन उपकरण प्रयोग गर्नुहोस्।55°C मा, RNA को माध्यमिक संरचना अझै धेरै जटिल छ, रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेजले काम गर्न सक्दैन, र माध्यमिक संरचना 65°C सम्म पूर्ण रूपमा समाधान गर्न सकिँदैन, जबकि AMV र M-MLV को अधिकतम तापक्रम यो तापक्रम भन्दा धेरै कम हुन्छ।
के गर्ने?माध्यमिक संरचना भनेको टेम्प्लेटको पूरक जोडी हो, जसले प्राइमर र रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेज र टेम्प्लेटको बीचमा कडा प्रतिस्पर्धा निम्त्याउँछ, जसको परिणामस्वरूप कम E र खराब दोहोरिने क्षमता जस्ता समस्याहरूको श्रृंखला हुन्छ।

के गर्ने?केवल सकेसम्म एनेलिङ तापमान बढाउनुहोस्।

धेरै अभिकर्मक निर्माताहरूले आनुवंशिक ईन्जिनियरिङ् मार्फत आफ्नो रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेज सुधार गर्दै छन्।केहीले प्रतिक्रियाको तापक्रम बढाउँछन्, जस्तै जिफान र आइडेलाई, र केहीले इन्जाइम र आरएनए टेम्प्लेट बीचको सम्बन्ध सुधार गर्न RNase H इन्जाइमको सक्रिय समूह हटाउँछन्।उच्च आत्मीयताले प्रतिस्पर्धात्मक रूपमा माध्यमिक संरचनालाई निचोड गर्न सक्छ र सजिलैसँग पढ्न सक्छ, र उल्टो ट्रान्सक्रिप्सनको दक्षतामा पनि धेरै सुधार गर्दछ।
मुख्य बिन्दु: रिभर्स ट्रान्सक्रिप्सन रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन दक्षताको स्थिरतालाई पछ्याउनको लागि धेरै महत्त्वपूर्ण छ (इन्जाइमहरू प्रभावकारी मात्र होइन तर स्थिर पनि हुनुपर्दछ), नमूना लोड गरिएको मात्राको सट्टा, यदि यो विशेष रूपमा ठूलो स्तरको फ्लोरोसेन्ट परिमाणात्मक PCR होइन भने, यो सम्भव हुनेछैन।धेरै cDNAs।
विभिन्न निर्माताहरूले स्थिरताको खोजीमा केही प्रयासहरू पनि गरेका छन्।उदाहरणका लागि, धेरै कम्पनीहरूले अब बिक्रीको लागि मानक किटको रूपमा रिभर्स ट्रान्सक्रिप्सन प्याकेज गरेका छन्, जुन राम्रो विकल्प हो।
उदाहरण को लागी, Foregene को RT Easy Series kits:

RT Easy I (पहिलो स्ट्र्यान्ड cDNA संश्लेषण किटको लागि मास्टर प्रिमिक्स)

MIQE (5) - लक्षित जीन जानकारी

माथिको चित्रले व्याख्या गर्छ
1. यो जीन बारम्बार प्रयोगहरूको लागि प्रभावकारी छ कि छैन सामान्यतया दोहोर्याइएको प्रयोगहरू द्वारा प्रमाणित गर्न सकिन्छ।
2. जीन आईडी, तपाईंलाई थाहा छ।
3. जीन लम्बाइ, लक्ष्य जीनको कुल लम्बाइ निश्चित रूपमा कुनै समस्या छैन।प्राइमरहरू डिजाइन गर्दा, राम्रो प्रवर्द्धन दक्षता सुनिश्चित गर्न एम्प्लिकनको लम्बाइ 80-200bp बीचको छ भनी सुनिश्चित गर्नुहोस्।
4. अनुक्रम ब्लास्ट तुलना जानकारी, लक्ष्य जीन गैर-विशिष्ट प्रवर्धन रोक्न genebank मा तुलना गर्न आवश्यक छ।
5. स्यूडोजेन्सको उपस्थिति।स्यूडोजेन सामान्य जीन जस्तै डीएनए अनुक्रम हो तर यसको सामान्य कार्य गुमाउँछ।यो प्रायः युकेरियोट्सको बहु-जीन परिवारमा अवस्थित हुन्छ।यो सामान्यतया ψ द्वारा प्रतिनिधित्व गरिन्छ।यो जीनोममा एक गैर-कार्यात्मक जीनोमिक डीएनए प्रतिलिपि हो जुन कोडिङ जीन अनुक्रमसँग मिल्दोजुल्दो छ।, सामान्यतया ट्रान्सक्राइब गरिएको छैन, र कुनै स्पष्ट शारीरिक अर्थ छैन।
6. exons र introns सापेक्ष प्राइमर को स्थिति।प्रारम्भिक वर्षहरूमा, जब हामीले DNA प्रदूषणको समस्या समाधान गर्यौं, हामीले प्राय: प्राइमरहरू, एक्सनहरू, र इन्ट्रोनको स्थितिहरूमा ध्यान दिएका थियौं, र सामान्यतया DNA प्रवर्धनबाट बच्न इन्ट्रोनहरूमा प्राइमरहरू डिजाइन गर्ने विचार गर्यौं।कृपया तलको चित्र हेर्नुहोस्: कालोले इन्ट्रोनलाई प्रतिनिधित्व गर्दछ, विभिन्न ब्लुजले एक्सोनहरू, गुलाबीले सामान्य प्राइमरहरूलाई प्रतिनिधित्व गर्दछ, र उज्यालो रातोले इन्ट्रोन-स्प्यानिङ प्राइमरहरूलाई प्रतिनिधित्व गर्दछ।

योजनाबद्ध, कहिल्यै सत्य
यो कस्तो उत्तम योजना देखिन्छ, तर वास्तवमा, प्रायजसो अवस्थामा, ट्रान्स-इन्ट्रोन प्राइमरहरू कल्पना गरेजस्तो जादुई छैनन्, र तिनीहरूले गैर-विशिष्ट प्रवर्धन पनि गर्नेछन्।त्यसैले DNA दूषित हुनबाट जोगिने उत्तम उपाय भनेको DNA पूरै हटाउनु हो।
7. कन्फर्मेशन भविष्यवाणी।यो उदाहरण पुन: प्रयोग गर्दै, mFold अनलाइन उपकरण प्रयोग गर्नुहोस् लक्षित खण्डको माध्यमिक संरचना निश्चित तापमान र नुन एकाग्रतामा निर्धारण गर्न।

विभिन्न तापमानमा RNA को माध्यमिक संरचना
माध्यमिक संरचना भनेको टेम्प्लेटको पूरक जोडी हो, जसले प्राइमर र टेम्प्लेट जोडाहरू बीच कडा प्रतिस्पर्धाको नेतृत्व गर्नेछ, र प्राइमर बाइन्डिङको सम्भावना कम छ, जसको परिणामस्वरूप कम E र खराब दोहोरिने क्षमता जस्ता समस्याहरूको श्रृंखला हुन्छ।सफ्टवेयर भविष्यवाणी मार्फत, यदि त्यहाँ कुनै माध्यमिक संरचना समस्या छैन भने, त्यो राम्रो हुनेछ।यदि त्यहाँ छ भने, हाम्रो अनुवर्ती लेखले यो समस्या कसरी समाधान गर्ने भनेर विशेष रूपमा छलफल गर्नेछ।

MIQE (6)-qPCR ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स

फ्लोरोसेन्ट मात्रात्मक PCR को लागि, तपाईंले हरेक दिन संघर्ष गर्नु पर्ने पहिलो कुरा RNA निकासी हो, र दोस्रो कुरा प्राइमर डिजाइन हुन सक्छ।
सबैभन्दा पहिले, हामी अझै पनि MIQE चेकलिस्ट अनुसार प्राइमर डिजाइन बारे नियमहरू जाँच गर्छौं।यो यति सरल छ कि स्कम्ब्यागहरू हाँस्न सक्छन्, र हामी यसलाई एक वाक्यमा समाप्त गर्न सक्छौं: प्राइमर प्रोबको क्रम र स्थिति र परिमार्जन विधि पत्ता लगाउनुहोस्।प्राइमर शुद्धिकरण विधिको लागि, प्राइमर संश्लेषण हाल सस्तो छ, qPCR PAGE र माथिको शुद्धिकरण विधिहरूको लागि योग्य छ, र संश्लेषण उपकरणको जानकारी महत्त्वपूर्ण छैन।धेरै मानिसहरू दशकौंदेखि प्राइमरहरू गर्दै छन् र सिन्थेसाइजर ABI3900 हो भनेर थाहा छैन।
प्राइमर डिजाइनका सिद्धान्तहरूको सन्दर्भमा, तपाईंले तिनीहरूलाई रोट गरेर सम्झनु पर्दैन, किनकि प्रायः प्राइमर डिजाइन सफ्टवेयर वा अनलाइन उपकरणहरूले यी समस्याहरूको हेरचाह गर्न सक्छन् (सिफारिस गरिएको अनलाइन उपकरण primer3.ut.ee/), र 99.999% प्राइमर डिजाइन म्यानुअल रूपमा गरिएको छैन, हेर्नुहोस्, लेखकले कहिलेकाहीँ सयौं प्राइमरहरू एक दिन डिजाइन गर्छन्, यदि तपाईंले एक-एक गरेर पढ्नुभयो भने, यो क्रस हुनेछ।
प्राइमरहरू डिजाइन गरिसकेपछि मात्र निम्न बिन्दुहरू जाँच गर्नुहोस्:
1. डिजाईन प्राइमरहरू 3′ छेउको नजिक: cDNA फर्स्ट-स्ट्र्यान्ड संश्लेषणको लागि ओलिगो डीटी प्राइमरहरू प्रयोग गर्ने अवस्थामा, रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन दक्षता र RNA अखण्डतालाई ध्यानमा राख्दै, डिजाइन गरिएको प्राइमरहरू एम्प्लीफिकेशन दक्षता सुधार गर्न 3′ छेउको नजिक डिजाइन गर्न आवश्यक छ।निम्नानुसार व्याख्या गर्न चित्र प्रयोग गर्नुहोस् (यसलाई बुझ्नको लागि कुनै तरिका छैन):

किन प्राइमरहरू 3′ अन्तको नजिक डिजाइन गरिनु पर्छ, यो सत्य हुनु हुँदैन
2. TM मान: Tm मान 55-65°C मा छ (किनभने exonuclease गतिविधि 60°C मा उच्चतम छ), र GC सामग्री 40%-60% मा छ।
3. ब्लास्ट: जीनोमको गैर-विशिष्ट प्रवर्धनबाट बच्नको लागि, पूरक प्रमाणीकरणको लागि ब्लास्ट प्रयोग गर्नुपर्छ।

MIQE(7)-qPCR प्रक्रिया

1. qPCR किट
MIQE को आवश्यकताहरू अनुसार, हामीले लेखमा पूर्ण प्रतिक्रिया अवस्थाहरू स्पष्ट रूपमा वर्णन गर्नुपर्छ, PCR प्रतिक्रिया प्रणालीको कन्फिगरेसन, कुन किट प्रयोग गरिन्छ, निर्माता को हो, प्रतिक्रिया प्रणाली कति ठूलो छ, डाई विधि वा प्रोब विधि प्रयोग गरिन्छ, PCR कार्यक्रम सेटिङहरू।दिग्गज चालकहरूले निश्चित रूपमा फेला पार्नेछन् कि जबसम्म किट चयन गरिएको छ, माथिको जानकारी मूल रूपमा निर्धारण गरिएको छ।
हाल, फ्लोरोसेन्ट परिमाणात्मक पीसीआर किटहरूको निर्माण र उत्पादन एक धेरै परिपक्व प्रविधि हो।जबसम्म तपाइँ अत्यन्त खराब निर्माताहरू छनौट गर्नुहुन्न, समस्याहरूको सम्भावना उच्च छैन, तर हामी अझै तपाइँसँग केहि बिन्दुहरू साझा गर्न चाहन्छौं:
हट-स्टार्ट Taq इन्जाइम:PCR को सबैभन्दा महत्त्वपूर्ण भाग हट-स्टार्ट Taq इन्जाइम हो।बजारमा हट-स्टार्ट इन्जाइमहरू सामान्यतया दुई प्रकारमा विभाजित हुन्छन्, एउटा रासायनिक रूपमा परिमार्जन गरिएको हट-स्टार्ट इन्जाइम हो (तपाईं यसलाई प्याराफिन इम्बेडिङको रूपमा कल्पना गर्न सक्नुहुन्छ), र अर्को एन्टिबडी परिमार्जनका लागि हट-स्टार्ट इन्जाइम हो (एन्टिजेन-एन्टिबडी बाइन्डिङ)।रासायनिक परिमार्जन तातो सुरु हुने इन्जाइमहरूको प्रारम्भिक तरिका हो।जब एक निश्चित तापमान पुग्छ, इन्जाइमले आफ्नो गतिविधि जारी गर्नेछ।एन्टिबडी-परिमार्जित हट-स्टार्ट इन्जाइमले इन्जाइमको गतिविधिलाई रोक्न जैविक विधिहरू प्रयोग गर्दछ।जब एक निश्चित तापमान पुग्छ, एन्टिबडी विकृत हुनेछ र प्रोटीनको रूपमा निष्क्रिय हुनेछ, र इन्जाइम गतिविधि खेलमा ल्याइनेछ।

तर, यसबाट के फाइदा हुन्छ ?यो मामला हो, एन्टिबडी-परिमार्जित इन्जाइमहरूको रिलीज गतिविधि रासायनिक रूपले परिमार्जित इन्जाइमहरूको भन्दा छिटो हुन्छ, त्यसैले संवेदनशीलताको हिसाबले, एन्टिबडी-परिमार्जित इन्जाइमहरूको थोरै फाइदा हुन्छ, ताकि बजारमा किटहरूमा मूल रूपमा कुनै रासायनिक परिमार्जित इन्जाइमहरू छैनन्।यदि त्यहाँ छ भने, यो निर्माताको प्रविधि अझै सहस्राब्दीको युगमा अड्किएको छ।
म्याग्नेसियम आयन एकाग्रता:म्याग्नेसियम आयन एकाग्रता PCR प्रतिक्रिया मा धेरै महत्त्वपूर्ण छ।उपयुक्त म्याग्नेशियम आयन एकाग्रताले Taq इन्जाइम गतिविधिको रिलीजलाई बढावा दिन सक्छ।यदि एकाग्रता धेरै कम छ भने, इन्जाइम गतिविधि उल्लेखनीय रूपमा कम हुनेछ;यदि एकाग्रता धेरै उच्च छ भने, इन्जाइम-उत्प्रेरित गैर-विशिष्ट प्रवर्धन बढाइनेछ।म्याग्नेसियम आयनहरूको एकाग्रताले प्राइमरहरूको एनिलिङ, टेम्प्लेट र PCR उत्पादनहरूको पग्लिने तापक्रमलाई पनि असर गर्छ, जसले गर्दा एम्प्लीफाइड टुक्राहरूको उत्पादनलाई असर गर्छ।म्याग्नेसियम आयनहरूको एकाग्रता सामान्यतया 25mM मा नियन्त्रण गरिन्छ।निस्सन्देह, राम्रो किटको लागि, म्याग्नेसियम आयनहरूको एकाग्रता राम्रोसँग नियन्त्रण हुनुपर्छ।केही व्यापारीहरूले अभिकर्मकमा म्याग्नेसियम आयन चेलेटिंग एजेन्ट थप्छन्, जसले म्याग्नेसियम आयन एकाग्रताको स्वचालित समायोजनको प्रभाव प्राप्त गर्न सक्छ।
फ्लोरोसेन्ट डाई एकाग्रता:फ्लोरोसेन्ट डाई, जुन SYBR ग्रीन हो जुन हामीले सामान्यतया प्रयोग गर्छौं, मुख्यतया डबल-स्ट्र्यान्ड डीएनएको माइनर ग्रूभमा बाँधिएर फ्लोरोसेन्स उत्पन्न गर्दछ, किनभने डबल-स्ट्र्यान्ड डीएनएमा डाईको बाइन्डिङ गैर-विशिष्ट हुन्छ, अर्थात् जबसम्म डबल-स्ट्र्यान्डेड डीएनए हुन्छ, यो टेम्पर-स्ट्र्यान्डेड डीएनएसँग मिलाएर फ्लुरोसेन्स हुन सक्छ। प्रणाली एक पृष्ठभूमि संकेत बनाउन यो संग संयोजन हुनेछ।
PS: यसको प्रकाश-संवेदनशील गुणहरूको कारण, बजारमा उत्पादनहरू सामान्यतया खैरो अपारदर्शी सेन्ट्रीफ्यूज ट्यूबहरूमा प्याकेज गरिन्छ (तलको चित्रमा देखाइएको छ)।तर, यो समस्या सामना हुनेछ।नमूना लिँदा तरल पदार्थ चुसेको छ कि छैन भनेर हेर्न गाह्रो हुन्छ।यस सन्दर्भमा, Qingke वास्तवमा सबैभन्दा प्रयोगकर्ता-अनुकूल छ (तलको चित्रमा देखाइएको छ), र पारदर्शी ट्यूब अपारदर्शी टिन झोलामा प्याकेज गरिएको छ।त्यसपछि प्रकाश र नमूना बेवास्ता गर्ने सुविधालाई ध्यानमा राख्दै यसलाई टिनको झोलामा राख्नुहोस्।तपाईंले सही उत्पादन नम्बर छनौट गर्नुपर्छ।TSE204 एक सुपर लागत-प्रभावी अस्तित्व हो, जसले मलाई घाँस रोप्न चाहन्छ।

फ्लोरोसेन्ट डाईको एकाग्रता पनि धेरै महत्त्वपूर्ण छ।यदि एकाग्रता धेरै कम छ भने, एम्प्लीफिकेशन वक्र पछिको चरणमा माथि जानेछैन र सही छैन;यदि एकाग्रता धेरै उच्च छ भने, यसले आवाज हस्तक्षेप निम्त्याउनेछ।फ्लोरोसेन्ट परिमाणात्मक PCR मुख्यतया CT मानमा निर्भर हुने भएकोले, यदि फ्लोरोसेन्ट डाईको एकाग्रतालाई ठीकसँग समायोजन गरिएको छैन भने, उच्च बिन्दु भन्दा तल्लो बिन्दु राम्रो हुन्छ।निस्सन्देह, उपयुक्त डाई एकाग्रता सबै भन्दा राम्रो छ।

ROX: ROX रङहरू राम्रोसँग प्रतिदीप्ति संकेत त्रुटिहरूको लागि सच्याउन प्रयोग गरिन्छ।केही उपकरण निर्माताहरूलाई क्यालिब्रेसन चाहिन्छ, जबकि अरूले गर्दैनन्।उदाहरणका लागि, थर्मो फिशर साइन्टिफिकको रियल टाइम PCR एम्प्लीफिकेशन उपकरणको प्रयोगलाई सामान्यतया 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus, आदि सहित क्यालिब्रेसन आवश्यक हुन्छ। सामान्य किट निर्देशनहरूले यसलाई वर्णन गर्नेछ।
Foregene को qPCR मिक्समा ROX डाई पनि हुन्छ, जुन विभिन्न मोडलहरूमा प्रयोग गर्नको लागि सुविधाजनक छ।

वास्तविक समय PCR किट-Takman

कमजोर हाइड्रोजन बन्ड उपचार: कमजोर हाइड्रोजन बन्ड को उपचार एक अपेक्षाकृत प्राविधिक कुरा हो।धेरै किटहरूको म्यानुअलहरू केही पनि पढेका छैनन्, तर तिनीहरूमध्ये कसैले पनि यो विषय उल्लेख गरेन।वास्तवमा, यो धेरै महत्त्वपूर्ण छ।आधारहरूको संयोजन मुख्यतया हाइड्रोजन बन्डको बलमा निर्भर गर्दछ।बलियो हाइड्रोजन बन्डहरू सामान्य प्रवर्धन हुन्, र कमजोर हाइड्रोजन बन्डहरूले गैर-विशिष्ट प्रवर्धनको नेतृत्व गर्दछ।यदि कमजोर हाइड्रोजन बन्डहरू राम्रोसँग हटाउन सकिँदैन भने, गैर-विशिष्ट प्रवर्धनलाई बेवास्ता गर्न सकिँदैन।लेखकको दायरा भित्र, केवल केहि कम्पनीहरूले यो समस्या देखेका छन्।जब तपाइँ किट खरिद गर्नुहुन्छ, तपाइँ तपाइँले किट छनौट गर्न चाहनु भएको किटको लागि तपाइँले यस सम्बन्धमा समाधान विचार गर्नुभएको छ कि छैन भनेर सन्दर्भ गर्न सक्नुहुन्छ।

प्रतिक्रिया मात्रा: 20-50ul प्रणाली अधिक सामान्य रूपमा प्रयोग गरिन्छ, र साना भोल्युमहरूले त्रुटिहरू निम्त्याउन सक्छ।सामान्यतया, किट निर्देशनहरूले PCR प्रतिक्रिया भोल्युमहरू प्रयोग गर्न सिफारिस गर्नेछ।स्मार्ट नहुनुहोस् र लागत बचत गर्न सानो मात्रा प्रयोग गर्नुहोस्।को लक्ष्य।व्यापारीहरूले सिफारिस गरेको भोल्युम वास्तवमा परीक्षण गरिएको छ, र यो हुन सक्छ कि तिनीहरूले सानो भोल्युमको कारण त्रुटिहरूको समस्या समाधान गर्न सक्दैनन्।
2. ट्यूब प्लेटको निर्माता र लेख नम्बर
फ्लोरोसेन्ट मात्रात्मक पीसीआर को सिद्धान्त सबैलाई थाहा छ।फ्लोरोसेन्स सङ्कलन मुख्यतया पीसीआर ट्यूब क्याप्स मार्फत गरिन्छ।PCR उपभोग्य वस्तुहरू छनौट गर्दा, दुईवटा बिन्दुहरूमा ध्यान दिनुहोस्: राम्रो प्रकाश प्रसारण र उपकरणको लागि उपयुक्त।सामान्यतया, मुख्यधारा ब्रान्डहरूको बोर्ड र ट्यूबहरू ठीक छन्, तर तपाईंले अनुकूलनको सन्दर्भमा सावधानीपूर्वक छनौट गर्नुपर्छ, अन्यथा तपाईं उपकरण प्रयोग गर्न सक्षम हुनुहुने छैन।

4. शीर्ष स्तरको ज्ञान

MIQE (8)-qPCR प्रमाणीकरण
यो qPCR को शीर्ष प्राथमिकता हो!धेरै नायकहरू यहाँ बालुवामा खसेका छन्।निस्सन्देह, यो पनि सम्भव छ कि तपाईं भाग्यशाली हुनुहुन्छ र तपाईंले अध्ययन गर्नुभएको जीनहरू सरल छन्, त्यसैले तपाईं हावासँगै बरफको गुफाबाट तैरनुभयो।qPCR को प्रमाणिकरण जानकारी डाटाको विश्वसनीयता परीक्षण गर्न को लागी हो।हामी निम्नानुसार आवश्यक प्रमाणीकरण जानकारी सूचीबद्ध गर्दछौं:

1. विशिष्टता परीक्षण
लक्षित जीन प्रवर्धनको विशिष्टता इलेक्ट्रोफोरेसिस चित्र एकल ब्यान्ड हो कि होइन भनेर जाँच गरेर परीक्षण गरिन्छ;अनुक्रम प्रमाणीकरण;शिखर नक्सा एकल छ कि छैन भनेर हेर्नको लागि पिघलने वक्र;इन्जाइम पाचन प्रमाणीकरण र अन्य विधिहरू।
यहाँ, हामी टी मा फोकसपिघलने वक्र को विधि प्रयोग गरेर गैर-विशिष्ट प्रवर्धन को विश्लेषण।सामान्यतया, जब हामी प्राइमरहरू डिजाइन गर्छौं, उत्पादनको टुक्राको आकार 80-200bp को दायरामा हुन आवश्यक छ, जसले PCR उत्पादनको 80-85 °C दायरा पग्लने तापमान बनाउँछ।त्यसकारण, यदि त्यहाँ विविध चुचुराहरू छन् भने, त्यहाँ अन्य गैर-विशिष्ट प्रवर्धन उत्पादनहरू हुनुपर्छ;यदि शिखर 80 डिग्री सेल्सियस भन्दा कम देखिन्छ भने, यसलाई सामान्यतया प्राइमर डाइमर मानिन्छ;यदि शिखर 85 डिग्री सेल्सियस भन्दा माथि देखा पर्यो भने, यसलाई सामान्यतया डीएनए प्रदूषण वा ठूला टुक्राहरूको अधिक गैर-विशिष्ट प्रवर्धन मानिन्छ।
नोट: कहिलेकाहीँ त्यहाँ 80 डिग्री सेल्सियसमा मात्र एक चोटी छ।यस समयमा, यो अवधारणा पालन गर्नुपर्छ।यो सम्भव छ कि प्रवर्धन परिणामहरू सबै प्राइमर डाइमरहरू हुन्।

सामान्य पिघलने वक्र (कुनै गैर-विशिष्ट प्रवर्धन बिना एकल शिखर)

समस्याग्रस्त पिघलने वक्र (नक्कली चुचुराहरूको गैर-विशिष्ट प्रवर्धन)
【केस विश्लेषण】

त्यहाँ एक मुख्य शिखर छ, तर प्राइमर डाइमर गम्भीर छ
तलको चित्रमा रहेको सिंगल-पीक पिघलने वक्रले सजिलैसँग तपाईंको आँखालाई धोका दिन सक्छ, यो सोचेर यो एक उत्तम प्रयोग हो, तर परिणाम पूर्ण रूपमा गलत छ।यस समयमा, हामीले पग्लने तापमान हेर्नु पर्छ।उच्चतम तापमान 80 डिग्री सेल्सियस भन्दा कम छ, जुन पूर्ण रूपमा प्राइमर-डिमर हो।

कुनै लक्ष्य टुक्रा छैन, सबै प्राइमर डाइमरहरू
यहाँ, मेरो भाइ रोक्न सक्दैन।तलको तस्बिर मलाई एक बदमासले पठाएको मोबाइल फोनबाट खिचेको फोटो हो।उनले प्रयोग गरेका अभिकर्मकहरू उद्योगमा प्रायः प्रयोग हुने ब्रान्डहरू हुन्।उहाँले एउटा T-उपसर्ग ब्रान्डबाट अर्को T-उपसर्ग ब्रान्डमा परिवर्तन गर्नुभयो।मलाई लाग्छ तपाईंले पहिले नै अनुमान गरिसक्नुभएको छ।स्कम्ब्यागले मलाई रोयो: "पहिलो चित्रमा प्रयोग गरिएको अभिकर्मक धेरै राम्रो छ, र शिखर एकल छ।पछि, तपाईंले सिफारिस गर्नुभएको अभिकर्मक प्रयोग गरिसकेपछि, यो मिश्रित चुचुराहरूको साथ दोस्रो चित्र जस्तै हुन्छ।तिमीले मलाई दुःखी बनायौ।"
दुई ग्राफ अलग गर्नुहोस्।पहिलो नजरमा, एउटामा एकल चुचुरो छ, र अर्कोमा डबल शिखर छ।बकवास, एक चोटी पक्कै पनि ठीक छ।के त्यो सत्य हो?
Dou E भन्दा खराब, यदि मैले तलको चित्रमा दुईवटा चित्रहरू राखें भने, तपाईंले तुरुन्तै बुझ्नुहुनेछ।वास्तवमा, हामी यस प्रकारको चित्रबाट सजिलै पक्षाघात भएका छौं।सावधानीपूर्वक विश्लेषण पछि, हामीले फेला पार्यौं: पहिलो आंकडाको शिखर 75 डिग्री सेल्सियसमा छ, जुन पूर्ण रूपमा प्राइमर डाइमर हो;दोस्रो फिगरको शिखर 75 डिग्री सेल्सियस र 82 डिग्री सेल्सियसमा देखा पर्दछ, कम्तिमा त्यहाँ उत्पादन देखिन्छ।

विद्यार्थीहरूबाट प्रतिक्रियाको चित्रहरू
त्यसैले आधारभूत समस्या अभिकर्मकहरूको समस्या होइन, तर प्राइमर डिजाइनको समस्या हो।एकै समयमा, यसले यो पनि प्रमाणित गर्दछ कि केहि ठूला ब्रान्डहरू फलामको गुणस्तरका छैनन्, र यसले मेरो भाइले पहिले भनेको कुरा पनि प्रमाणित गर्दछ: यो तपाईंको लेखलाई समर्थन गर्ने अभिकर्मक ब्रान्ड होइन।यो तपाईंको लेख हो जसले अभिकर्मकहरूको ब्रान्डलाई समर्थन गर्‍यो।कल्पना गर्नुहोस्, यदि स्कम्ब्यागले अभिकर्मकहरू परिवर्तन गरेन भने, गलत डाटा जर्नलमा पठाइनेछ, र के हुन्छ त्यो एक त्रासदी हुनेछ।
2. खाली नियन्त्रणको Ct मान
व्याख्या नगर्नुहोस्, यदि खाली नियन्त्रणको Ct मान छ भने, यो प्रदूषण होइन?यद्यपि, तपाईले अझै पनि बुझ्न आवश्यक छ कुन खाली नियन्त्रणमा Ct मान छ।यदि यो NTC हो भने, यसको मतलब त्यहाँ विदेशी डीएनए छ जस्तै अभिकर्मक प्रदूषण।यदि यो NRT हो भने, यसको मतलब निकालिएको RNA मा DNA संदूषण छ।
3. मानक वक्र
ढलान र गणना सूत्र सहित, PCR दक्षता सूत्र मार्फत गणना गर्न सकिन्छ।एक उत्तम प्रयोग 3.32 मा पुग्न मानक वक्र को ढलान आवश्यक छ, र 0.9999 मा पुग्न R²।
4. रैखिक गतिशील दायरा
प्रतिक्रियाको गतिशील दायरा रैखिक छ।मानक वक्र उत्पन्न गर्न प्रयोग गरिएको टेम्प्लेट अनुसार, गतिशील दायराले कम्तिमा 5 एकाग्रता ढाँचा समावेश गर्नुपर्छ, र उच्च एकाग्रता ढाँचा र कम एकाग्रता ढाँचाहरूमा Ct मानहरूको परिवर्तनमा ध्यान दिनुपर्छ।
5. पत्ता लगाउने शुद्धता
qPCR नतिजाहरूमा परिवर्तनहरू, अर्थात्, खराब दोहोरिने योग्यता, अर्थात्, खराब परिशुद्धता, तापमान, एकाग्रता, र सञ्चालन सहित धेरै कारकहरूले गर्दा हुन्छ।प्रतिलिपि संख्या घट्दा qPCR परिशुद्धता सामान्यतया कम नियन्त्रण योग्य हुन्छ।आदर्श रूपमा प्रयोगात्मक भिन्नता भित्र, यो प्राविधिक भिन्नता जैविक भिन्नताबाट फरक हुनुपर्छ, र जैविक प्रतिकृतिहरूले समूह वा उपचारहरू बीचको qPCR परिणामहरूमा तथ्याङ्कीय भिन्नताहरूलाई प्रत्यक्ष रूपमा सम्बोधन गर्न सक्छ।विशेष गरी डायग्नोस्टिक एसेसहरूको लागि, साइटहरू र अपरेटरहरूमा सबै भन्दा राम्रो अन्तर-परख परिशुद्धता (दोहोरिने योग्यता) रिपोर्ट गरिनु पर्छ।
6. पत्ता लगाउने दक्षता र LOD (मल्टिप्लेक्स qPCR मा)
LOD सकारात्मक नमूनाहरूको 95% पत्ता लगाइएको सबैभन्दा कम एकाग्रता हो।अर्को शब्दमा, लक्षित जीन प्रतिकृतिहरूको सेट भित्र रहेको LOD को एकाग्रता असफल प्रतिक्रियाहरूको 5% भन्दा बढी हुनु हुँदैन।मल्टिप्लेक्स qPCR विश्लेषण गर्दा, विशेष गरी बिन्दु उत्परिवर्तन वा पोलिमोर्फिजमको एकै साथ पत्ता लगाउनको लागि, मल्टिप्लेक्स qPCR ले प्रमाण प्रदान गर्न आवश्यक छ कि बहुविध लक्ष्य टुक्राहरूको शुद्धता एउटै ट्यूबमा सम्झौता गरिएको छैन, बहु पत्ता लगाउने र एकल ट्यूब पत्ता लगाउने दक्षता र LOD समान हुनुपर्छ।विशेष गरी जब उच्च-एकाग्रता लक्ष्य जीनहरू र कम-एकाग्रता लक्ष्य जीनहरू एकैसाथ प्रवर्धित हुन्छन्, यो समस्यामा ध्यान दिनु पर्छ।
समस्या र समाधानसामान्यतया, qPCR डिबगिङमा प्रायः समस्याहरू निम्न पक्षहरूमा केन्द्रित हुन्छन्:
गैर-विशिष्ट प्रवर्धन
प्राइमर एकाग्रताको कठिन छनोट र प्राइमर-डाइमरको साथ समस्या
· एनिलिङ तापमान गलत छ
माध्यमिक संरचनाले प्रवर्धन दक्षतालाई असर गर्छ
गैर-विशिष्ट प्रवर्धन
गैर-विशिष्ट प्रवर्धनहुन्छ, यो सामान्यतया विचार गरिन्छ कि प्राइमर डिजाइन उपयुक्त छैन, तर यदि तपाइँ प्राइमरहरू परिवर्तन गर्न हतारमा हुनुहुन्न भने, तपाइँ पहिले निम्न विधिहरू प्रयास गर्न सक्नुहुन्छ (सिद्धान्त पनि संलग्न छ):
· एनेलिङको तापक्रम बढाउनुहोस् - कमजोर हाइड्रोजन बन्डहरूलाई कायम राख्न असक्षम बनाउन प्रयास गर्नुहोस्;
एनेलिङ र लम्बाइको समय छोटो पार्नुहोस् - कमजोर हाइड्रोजन बन्डको सम्भावना कम गर्नुहोस्;
· प्राइमर एकाग्रता घटाउनुहोस् - अनावश्यक प्राइमरहरू र गैर-लक्ष्य क्षेत्रहरूको बाध्यताको सम्भावना कम गर्नुहोस्;
कम प्रवर्धन दक्षता
गैर-विशिष्ट प्रवर्धनको विपरीत स्थिति - कम प्रवर्धन दक्षता, र कम प्रवर्धन दक्षतासँग व्यवहार गर्ने उपायहरू ठीक उल्टो छन्:
एनेलिङ र लम्बाइ समय लम्ब्याउनुहोस्;
तीन-चरण पीसीआरमा परिवर्तन गर्नुहोस् र एनिलिङ तापमान घटाउनुहोस्;
प्राइमर एकाग्रता बढाउनुहोस्;
Ps: ९० को दशकमा जन्मेका धेरै स्नातक विद्यार्थीहरू प्रयोगहरू कसरी डिबग गर्ने भनेर अध्ययन गर्न चाहँदैनन्, र आशा छ कि किटले समस्या पूर्ण रूपमा समाधान गर्न सक्छ (यदि तपाईं स्नातक पछि अनुसन्धान र विकास गर्न अभिकर्मक कम्पनीमा जान चाहनुहुन्छ भने), वास्तवमा, अभिकर्मक निर्माताहरूले पनि यसरी सोच्छन्, म आशा गर्दछु कि यो मूर्खता हो जब तपाईले यसलाई प्रयोग गर्न सक्नुहुनेछ, त्यसैले निर्माताहरूको समस्या समाधान गर्न धेरै प्रयासहरू छन्। कमजोर एच-बन्ड अवशोषण कारकहरूको परिचय।समस्या सजिलै समाधान गर्न, मूर्खहरूले अझै पनि कमजोर हाइड्रोजन बन्डहरू अवशोषित गर्ने कारक छ कि भनेर हेर्न अभिकर्मक कम्पनीको परिचय पढ्नु पर्छ।
प्राइमर एकाग्रताको कठिन छनोट र प्राइमर-डाइमरहरूसँग समस्या
विधि १: सामान्यतया भन्नुपर्दा, qPCR को लागि किट निर्देशनहरूले प्रणालीहरू र सिफारिस गरिएको प्राइमर सांद्रता सिफारिस गरेको छ।
विधि २: प्राइमर एकाग्रता ग्रेडियन्ट सेट गरेर डिबग गर्दै।तलको तस्बिर एक कम्पनीबाट चोरिएको हो भनेर वर्णन गर्न।तलको चित्रले तीन प्राइमर एकाग्रता ढाँचा (100nM, 250nM, 500nM) र चार टेम्प्लेट एकाग्रता ढाँचा (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng) सँग बनाइएको फ्लोरोसेन्स मात्रात्मक परिणामहरू देखाउँछ।प्रयोगात्मक परिणामहरूको Ct मान निम्नानुसार प्लट गरिएको छ:

प्राइमर एकाग्रता चयन निम्नानुसार प्रत्येक प्राइमर एकाग्रतालाई रेखामा जोड्नुहोस्:

प्राइमर एकाग्रताको छनोट स्पष्ट छ, 100nM र 250nM को प्राइमर एकाग्रताको रैखिक सम्बन्ध राम्रो छ, र 500nM को प्राइमर एकाग्रताको रैखिक सम्बन्ध अपेक्षाकृत कमजोर छ।100nM र 250nM मा, 250nM को Ct मान अपेक्षाकृत सानो छ, त्यसैले इष्टतम प्राइमर एकाग्रता 250nM हो।सामान्यतया गम्भीर प्राइमर-डाइमरहरू पग्लने वक्रमा देख्न सकिन्छ।के हुन्छ यदि डिजाइन गरिएको प्राइमरहरूले प्राइमर-डाइमरहरू बेवास्ता गर्न सक्दैनन्?
विधि ३: प्राइमरको मात्रा घटाउनुहोस् र एनेलिङको तापक्रम बढाउनुहोस् (बनाउनु पर्दैन)।
annealing तापमान को अनुभवजन्य मान 60 डिग्री सेल्सियस छ।यदि तपाइँ निश्चित हुनुहुन्न भने, कसरी थप उपयुक्त annealing तापमान चयन गर्ने?जवाफ प्राइमर एकाग्रता को छनोट जस्तै छ -ग्रेडियन्ट परीक्षण।समस्या चित्रण गर्न Bio-rad कम्पनीबाट एक तस्वीर लिनुहोस्।निश्चित लक्ष्य टुक्राको प्रवर्धनको लागि, आठ तापक्रम ढाँचाहरू सेट गर्नुहोस्, प्रत्येक तीन पुनरावृत्तिसहित, र प्राप्त प्रवर्द्धन वक्र निम्नानुसार छ:

annealing तापमान चयन:
·70°C, 69°C—मूलतया, प्राइमरहरू जोड्न सकिँदैन, त्यसैले त्यहाँ कुनै प्रवर्धन हुँदैन।
·67.3°C - सुरुमा प्रवर्धनको सानो मात्रा छ, र Ct मान अपेक्षाकृत ठूलो छ।
·64.5°C——Ct मान घट्छ।
· 60.7°C, 58.0°C, 56.2°C, र 55.0°C मा, Ct मानहरू मूल रूपमा स्थिर हुन थाले, तर अन्तिम प्रतिदीप्ति मानहरू फरक थिए।
कसरी छनौट गर्ने?सिद्धान्त: पहिलो सिद्धान्त उच्च Ct मान हो।एउटै Ct मानको लागि, dimerization र गैर-विशिष्ट प्रवर्धनबाट बच्न उच्च एनेलिङ तापक्रम छान्नुहोस्।यद्यपि त्यहाँ 55 डिग्री सेल्सियसमा उच्च फ्लोरोसेन्स मान छ, त्यहाँ डाइमर वा गैर-विशिष्ट प्रवर्धन हुन सक्छ।
तर यदि तपाईं तपाईं जस्तै स्मार्ट हुनुहुन्छ भने, तपाईंले निश्चित रूपमा सोच्नुहुनेछ: तार्किक रूपमा भन्नुपर्दा, यदि PCR प्रतिक्रिया धेरै विशिष्ट छ, जबसम्म प्राइमर एकाग्रता न्यूनतम आवश्यकता भन्दा बढी छ, फ्लोरोसेन्ट रङहरू र dNTPs जस्तै, उच्च र निम्न बिन्दुहरूमा कुनै प्रभाव हुँदैन।वास्तवमा, जबसम्म annealing तापमान ठीकसँग अनुकूलित हुन्छ, Ct मानमा प्राइमर एकाग्रताको प्रभाव स्वाभाविक रूपमा कम हुनेछ।

एनेलिङको तापक्रम ठीकसँग अप्टिमाइज गरिएको छ, र CT मा प्राइमर एकाग्रताको प्रभावलाई कम गरिनेछ।
माध्यमिक संरचनाले प्रवर्धन दक्षतालाई असर गर्छ
समस्या चित्रण गर्न Bio-rad बाट तस्वीर लिनुहोस्।यसले माध्यमिक संरचनाको साथ जीनलाई विस्तार गर्न तापमान ढाँचा पनि डिजाइन गर्दछ।

माध्यमिक संरचना देखापर्छ
यो देख्न सकिन्छ कि तापक्रम ढाँचा घट्दै जाँदा, उत्पादनहरू देखा पर्न थाल्छन् र Ct मान अगाडि बढ्छ, न्यूनतम मान 60.7 डिग्री सेल्सियसमा पुग्छ, र त्यसपछि तापमान ढाँचा घट्दै जाँदा, Ct मान ठूलो हुन्छ।यसको विपरीत, तापक्रम बढ्दै जाँदा, माध्यमिक संरचना खुल्छ र प्रवर्धन दक्षता बढ्छ।एक निश्चित तापमानमा पुगेपछि, तापक्रम वृद्धिले प्रवर्धन दक्षता सुधार गर्न सक्दैन।किनभने यस समयमा प्राइमरहरू स्थिर रूपमा जोड्न सकिँदैन।त्यसैले,न्यूनतम Ct मानको साथ तापक्रम खोज्नुहोस्, जुन माध्यमिक संरचना टेम्प्लेट प्रवर्द्धनका लागि उत्तम तापक्रम हो!निस्सन्देह, स्मार्ट मूर्खहरूले थाहा पाउनु पर्छ कि यदि यो आवश्यक छैन भने, प्राइमरहरू परिवर्तन गर्न र माध्यमिक संरचना क्षेत्रबाट बच्न उत्तम हुन्छ।
5. आवेदन स्तर
MIQE - डाटा विश्लेषण

डाटा विश्लेषण मुख्यतया फ्लोरोसेन्ट मात्रात्मक पीसीआर उपकरण द्वारा दिइएको छ।अघिल्लो लेखमा, धेरै डाटा विश्लेषण कार्यहरू गरिएको छ, जस्तै खाली नियन्त्रण, जुन प्रयोगको डिजाइनमा व्याख्या गरिएको छ।आन्तरिक सन्दर्भ जीन, दोहोरिने संख्याहरू, आदि स्पष्ट गरिएको छ।, यहाँ हामी मुख्यतया qPCR को आवेदन व्याख्या गर्छौं।
qPCR व्यापक रूपमा प्रयोग गरिन्छ, र प्रयोगात्मक प्रमाणीकरण र न्यूक्लिक एसिड निदान सबैभन्दा सामान्य रूपमा प्रयोग हुने परिदृश्यहरू हुन्।
निरपेक्ष परिमाणीकरण
लग (प्रारम्भिक एकाग्रता) को चक्र संख्या संग एक रैखिक सम्बन्ध छ।एक मानक वक्र ज्ञात प्रारम्भिक प्रतिलिपि नम्बरको साथ मानकबाट कोर्न सकिन्छ, त्यो हो, प्रवर्धन प्रतिक्रियाको रेखीय सम्बन्ध प्राप्त गर्न सकिन्छ।नमूनाको Ct मान अनुसार, नमूनामा एकाग्रता गणना गर्न सकिन्छ।समावेश गर्न टेम्प्लेटहरूको मात्रा।

निरपेक्ष मात्रात्मक गणना विधि
निरपेक्ष मात्रा मानक वक्र मा आधारित हुनुपर्छ।मानक वक्र बनाउन, एक मानक आवश्यक छ।सामान्यतया, मानक लक्ष्य जीन क्लोनिंग द्वारा प्राप्त प्लाज्मिड हो।यो किन प्लाज्मिड हो?किनभने गोलाकार प्लाज्मिड डीएनए सबैभन्दा स्थिर छ।दोब्बर अनुपात (10-गुना पातलो) अनुसार 5 देखि 6 ग्रेडियन्टहरूमा मानक उत्पादन पातलो गर्नुहोस्, र पातलो गर्दा एकरूपतामा ध्यान दिनुहोस्।Ct मान 15-30 को बीचमा घट्न दिनुहोस्।

मानक तयारी
एकै समयमा, परीक्षण गरिनु पर्ने नमूना पनि तदनुसार पातलो हुनुपर्छ (डिलुसन कारक सम्झनुहोस्), र Ct मान पनि 15-30 को बीचमा झर्नु पर्छ।मानक उत्पादन + परीक्षण गर्न नमूना मेसिनमा सँगै राखिन्छ।दौड पछि, मानक पदार्थको साथ एक मानक वक्र बनाइएको थियो, र परीक्षण गर्नका लागि नमूनाहरूलाई एकाग्रता गणना गर्न मानक वक्रमा ल्याइयो।
हेपाटाइटिस बी भाइरस HBV क्वान्टिफिकेशन एक विशिष्ट निरपेक्ष मात्रा हो, जसले रगतको 1ml मा भाइरस प्रतिलिपि संख्या गणना गर्न सक्छ।
प्रतिलिपि नम्बरको गणना
परीक्षण गरिने नमूना एकाग्रता (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × dilution factor
नमूना आणविक वजन = आधार संख्या × 324
परीक्षण गरिने नमूनाको प्रतिलिपि नम्बर (प्रतिलिपि/उल) = परीक्षण गरिने नमूनाको एकाग्रता / नमूनाको आणविक वजन × 6 × 1014

प्रतिलिपि नम्बरको गणना विधि

माथिको मात्रा निर्धारण को लागी गणना विधि हो।यो एउटा गणितीय समस्या हो जुन जुनियर हाई स्कूलबाट स्नातक गरेपछि हल गर्न सकिन्छ, र गणितीय समस्याहरू सामान्यतया कम्प्युटरहरूद्वारा हल गरिन्छ।यदि तपाईंले बुझ्नुभएको छैन भने, तपाईं संवाद गर्न आउन सक्नुहुन्छ।
सापेक्ष परिमाणीकरण
सापेक्ष परिमाणीकरण मुख्यतया वैज्ञानिक अनुसन्धानमा प्रयोग गरिन्छ।1ml रगतमा कति भाइरसहरू छन्, र यो एक DNA भाइरस हो, यो एक अपेक्षाकृत निर्धारणात्मक घटना हो: रगतको मात्रा निर्धारण गर्न सकिन्छ, र DNA भाइरस अपेक्षाकृत स्थिर छ।यद्यपि, हामीलाई पातमा कुनै निश्चित जीनको ट्रान्सक्रिप्शन प्रतिलिपिहरूको संख्या तुलना गर्न गाह्रो छ, किनकि पातको आकार, तौल र कोमलता निर्धारण गर्न गाह्रो छ, निकालिएको आरएनएको मात्रा निर्धारण गर्न गाह्रो छ, र रिभर्स ट्रान्सक्रिप्सनको दक्षता पनि निर्धारण गर्न गाह्रो छ, अर्थात्, कुनै पनि चरणले प्रयोगात्मक डाटा प्रयोग गर्न नसक्ने बनाउन सक्छ।
त्यसकारण, सापेक्ष परिमाणीकरणले एउटा तत्व परिचय गर्नुपर्छ:आन्तरिक सन्दर्भ जीन।
अर्को शब्दमा, सापेक्ष परिमाणीकरण वास्तवमा लक्षित जीन र आन्तरिक सन्दर्भ जीन बीचको तुलना हो।एउटै टिस्यु र एउटै सेलमा तुलना गर्दा, नमूना आकारको प्रभाव, आरएनए निकासी रकम, रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन दक्षता, र PCR दक्षता अपेक्षाकृत सानो छ।सानो नमूना आकारको कारण, दुबै आन्तरिक सन्दर्भ जीनहरू र लक्ष्य जीनहरू अपेक्षाकृत कम भएका थिए।यसकारण हामीले एकरूपता र स्थिरतालाई पहिले नै जोड दिँदै आएका छौं।
आन्तरिक सन्दर्भ जीनहरू सामान्यतया हुन्गृहकार्य जीन(हाउस-किपिङ जीन), जसले सबै कोषहरूमा स्थिर रूपमा व्यक्त गरिएका जीनहरूको वर्गलाई जनाउँछ, र तिनीहरूका उत्पादनहरू कोशिकाहरूको आधारभूत जीवन गतिविधिहरू कायम राख्न आवश्यक हुन्छन्।
यो अवधारणा भ्रमित नगर्नुहोस्।हाउसकीपिङ जीनहरू जैविक कार्य सर्तहरू हुन्, जबकि आन्तरिक सन्दर्भ जीनहरू प्रयोगात्मक प्राविधिक सर्तहरू हुन्।हाउसकीपिङ जीनहरूले आन्तरिक सन्दर्भ जीनको रूपमा चयन गर्न सक्नु अघि प्रमाणीकरण पास गर्न आवश्यक छ।
उदाहरणका लागि, हामीले विभिन्न तन्तु कक्षहरूमा तिनीहरूको अभिव्यक्ति स्तरहरू परीक्षण गर्न तलको चित्रमा धेरै हाउसकीपिङ जीनहरू चयन गर्यौं, र पत्ता लगायौं कि β-2-माइक्रोग्लोबुलिनको अभिव्यक्ति स्तरहरू अन्य तीन जीनहरू भन्दा धेरै फरक थिए, त्यसैले तिनीहरूलाई आन्तरिक सन्दर्भ जीनको रूपमा प्रयोग गर्न सकिँदैन।

आन्तरिक सन्दर्भ जीनको सुधार कार्य बुझेपछि, आन्तरिक सन्दर्भ जीनको परिचयको कारणले दुई एल्गोरिदमहरू प्राप्त हुन्छन्।
· दोहोरो मानक वक्र विधि
·2 – △△Ct विधि (CT मान तुलना विधि)
यदि तपाइँ प्रजातिहरू र जीन प्रकार्यहरू अध्ययन गर्न इच्छुक हुनुहुन्छ भने, कृपया एल्गोरिदमहरूमा अनुसन्धान छोड्नुहोस् र सिधै सूत्रहरू प्रयोग गर्नुहोस्, वा सिधै मेसिनहरू प्रयोग गर्नुहोस्;यदि तपाईं गणित र ईन्जिनियरिङ् मा एक सीधा मान्छे हुनुहुन्छ भने, कृपया स्वतन्त्र महसुस गर्नुहोस्।
डबल मानक वक्र विधि
नियन्त्रण नमूनाको लक्ष्य जीन र हाउसकीपिङ जीन र मानक वक्र मार्फत परीक्षण गरिने नमूनाको परिमाण गर्नुहोस्, र त्यसपछि गणना सूत्र अनुसार सापेक्ष मान गणना गर्नुहोस्, जुन सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर हो।
फाइदाहरू: सरल विश्लेषण, अपेक्षाकृत सरल प्रयोगात्मक अनुकूलन
हानि: प्रत्येक जीनको लागि, प्रयोगहरूको प्रत्येक राउन्डले मानक वक्र बनाउनु पर्छ
आवेदन: जीन अभिव्यक्ति नियमन को अध्ययन मा दुई सबै भन्दा साधारण प्रयोग र मान्यता प्राप्त सापेक्ष मात्रात्मक विधिहरु मध्ये एक
सूत्र निम्नानुसार छ:

उदाहरणहरू निम्नानुसार छन्:

मात्रात्मक परिणामको आधारमा सापेक्ष रकम गणना गर्नुहोस्
२ – △△Ct विधि (CT मान तुलना विधि)

फाइदाहरू: मानक वक्र बनाउन आवश्यक छैन
हानि: यो प्रवर्धन दक्षता 100% को नजिक छ कि मानिन्छ;मानक विचलन <5% हो, र मानक वक्र र प्रत्येक एम्प्लीफिकेशन बीचको दक्षता एकरूप हुन मानिन्छ;प्रयोगात्मक अवस्थाहरूको अनुकूलन अधिक जटिल छ।
आवेदन: जीन अभिव्यक्ति नियमन को अध्ययन मा दुई सबै भन्दा साधारण प्रयोग र मान्यता प्राप्त सापेक्ष मात्रात्मक विधिहरु मध्ये एक

निस्सन्देह, प्रवर्द्धन दक्षता सामान्यतया पूर्ण रूपमा असम्भव छ 1। सुधार विधि: यदि हामीलाई थाहा छ कि लक्ष्य जीन र सन्दर्भ जीनको एम्प्लीफिकेशन दक्षता समान छ, तर प्रवर्द्धन दक्षता 1 बराबर छैन, तब 2－△△Ct लाई यसरी सुधार गर्न सकिन्छ: (1+C, amplification) उदाहरण －t, amplification ⼍t, 0.95 छ, त्यसपछि गणना सूत्र 1.95－△△Ct मा सच्याउन सकिन्छ
हालसम्म, फ्लोरोसेन्ट परिमाणात्मक पीसीआर बारे सामग्री समाप्त भएको छ।