ठूलो छुट चीन उच्च संवेदनशीलता वन-स्टेप प्रोब Rt-Qpcr Kit V2
किट विवरण:
◮सरल र प्रभावकारी: सेल डाइरेक्ट आरटी प्रविधिको साथ, आरएनए नमूनाहरू मात्र 7 मिनेटमा प्राप्त गर्न सकिन्छ।
◮नमूना माग सानो छ, जति कम 10 कक्षहरू परीक्षण गर्न सकिन्छ।
◮उच्च थ्रुपुट: यसले 384, 96, 24, 12, 6-वेल प्लेटहरूमा कल्चर गरिएका कक्षहरूमा आरएनए द्रुत रूपमा पत्ता लगाउन सक्छ।
◮डीएनए इरेजरले रिलिज भएको जीनोमहरू चाँडै हटाउन सक्छ, त्यसपछिको प्रयोगात्मक नतिजाहरूमा प्रभावलाई धेरै कम गर्न सक्छ।
◮अप्टिमाइज्ड RT र qPCR प्रणालीले दुई-चरण RT-PCR रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शनलाई अझ प्रभावकारी बनाउँछ र PCR थप विशिष्ट, र RT-qPCR प्रतिक्रिया अवरोधहरूलाई थप प्रतिरोधी बनाउँछ।
हामी अनुभवी निर्माता भएको छ।ठूलो छुट चीन उच्च संवेदनशीलता एक-चरण अनुसन्धान Rt- को लागि यसको बजारको महत्त्वपूर्ण प्रमाणपत्रहरूमा बहुमत जित्दै।Qpcrकिट V2, गुणस्तर कारखानाको जीवन हो, ग्राहकको मागमा फोकस गर्नु कम्पनीको अस्तित्व र विकासको स्रोत हो, हामी इमानदारी र राम्रो विश्वासको काम गर्ने मनोवृत्तिलाई पालन गर्छौं, तपाईंको आगमनको लागि तत्पर छौं!
हामी अनुभवी निर्माता भएको छ।को लागि यसको बजार को महत्वपूर्ण प्रमाणीकरण मा बहुमत जीतचीन Taq DNA पोलिमरेज, Qpcr, हाम्रो कम्पनीले प्रतिज्ञा गर्दछ: उचित मूल्यहरू, छोटो उत्पादन समय र सन्तोषजनक बिक्री पछि सेवा, हामी तपाईंलाई कुनै पनि समयमा हाम्रो कारखाना भ्रमण गर्न स्वागत गर्दछौं।अब हामीसँग रमाइलो र दीर्घकालीन व्यापार होस् भन्ने कामना !!!
विवरणहरू
यो किटले RT-qPCR प्रतिक्रियाहरूको लागि कल्चर्ड सेल नमूनाहरूबाट आरएनएलाई द्रुत रूपमा रिलिज गर्न सक्ने अद्वितीय lysis बफर प्रणाली प्रयोग गर्दछ, जसले गर्दा समय-उपभोग गर्ने र मेहनती RNA शुद्धिकरण प्रक्रियालाई हटाउँछ।आरएनए टेम्प्लेट मात्र 7 मिनेटमा प्राप्त गर्न सकिन्छ।किटद्वारा प्रदान गरिएको 5×Direct RT Mix र 2×Direct qPCR Mix-SYBR अभिकर्मकहरूले छिटो र प्रभावकारी रूपमा वास्तविक-समय मात्रात्मक PCR परिणामहरू प्राप्त गर्न सक्छन्।
5×Direct RT Mix र 2×Direct qPCR Mix-SYBR सँग बलियो अवरोधक सहिष्णुता छ, र नमूनाहरूको lysate लाई RT-qPCR को लागि टेम्प्लेटको रूपमा प्रयोग गर्न सकिन्छ।यो किटमा अद्वितीय आरएनए उच्च-सम्पर्क फोरेजीन रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेज, र हट D-Taq DNA पोलिमरेज, dNTPs, MgCl समावेश छ।2, प्रतिक्रिया बफर, PCR अनुकूलक र स्थिरता।
निर्दिष्टीकरणहरू
200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns
किट अवयवहरू
| भाग I | बफर CL |
| फोरजीन प्रोटीज प्लस II | |
| बफर ST | |
| भाग II | डीएनए इरेजर |
| 5× प्रत्यक्ष RT मिक्स | |
| 2× प्रत्यक्ष qPCR मिक्स-SYBR | |
| 50× ROX सन्दर्भ डाई | |
| RNase-मुक्त ddH2O | |
| निर्देशनहरू | |
सुविधाहरू र फाइदाहरू
■ सरल र प्रभावकारी: Cell Direct RT प्रविधिको साथ, RNA नमूनाहरू मात्र 7 मिनेटमा प्राप्त गर्न सकिन्छ।
■ नमूनाको माग सानो छ, जति कम 10 कक्षहरू परीक्षण गर्न सकिन्छ।
■ उच्च थ्रुपुट: यसले 384, 96, 24, 12, 6-वेल प्लेटहरूमा कल्चर गरिएका कक्षहरूमा आरएनए छिट्टै पत्ता लगाउन सक्छ।
■ DNA इरेजरले रिलिज भएको जीनोमहरू तुरुन्तै हटाउन सक्छ, त्यसपछिको प्रयोगात्मक नतिजाहरूमा प्रभावलाई धेरै कम गर्न सक्छ।
■ अप्टिमाइज गरिएको RT र qPCR प्रणालीले दुई-चरण RT-PCR रिभर्स ट्रान्सक्रिप्सनलाई अझ प्रभावकारी बनाउँछ र PCR थप विशिष्ट, र RT-qPCR प्रतिक्रिया अवरोधकहरूलाई थप प्रतिरोधी बनाउँछ।
किट आवेदन
आवेदनको दायरा: संवर्धित कक्षहरू।
- नमूना लिसिस द्वारा जारी गरिएको आरएनए: यो किटको RT-qPCR टेम्प्लेटमा मात्र लागू हुन्छ।
- किटलाई निम्न उद्देश्यका लागि प्रयोग गर्न सकिन्छ: जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण, siRNA- मध्यस्थ जीन साइलेन्सिङ प्रभावको प्रमाणीकरण, औषधि परीक्षण, आदि।
रेखाचित्र
भण्डारण र शेल्फ जीवन
यस किटको भाग I 4℃ मा भण्डारण गर्नुपर्छ;भाग II -20 ℃ मा भण्डारण गर्नुपर्छ।
फोरजीन प्रोटीज प्लस II 4 ℃ मा भण्डारण गर्नुपर्छ, -20 ℃ मा फ्रिज नगर्नुहोस्।
अभिकर्मक 2×प्रत्यक्ष qPCR मिक्स-SYBR अँध्यारोमा -20℃ मा भण्डारण गर्नुपर्छ;यदि बारम्बार प्रयोग गरिन्छ भने, यसलाई छोटो अवधिको भण्डारणको लागि 4℃ मा भण्डारण गर्न सकिन्छ (10 दिन भित्र प्रयोग गर्नुहोस्)। हामी अनुभवी निर्माता छौं।ठूलो छुट चीन उच्च संवेदनशीलता वन-स्टेप प्रोब Rt-Qpcr Kit V2 को लागि यसको बजारको महत्त्वपूर्ण प्रमाणपत्रहरूमा बहुमत जित्दै, गुणस्तर कारखानाको जीवन हो, ग्राहकको मागमा फोकस गर्नु कम्पनीको अस्तित्व र विकासको स्रोत हो, हामी इमानदारी र राम्रो विश्वासको काम गर्ने मनोवृत्ति पालन गर्छौं, तपाईंको आगमनको लागि उत्सुक छौं!
ठूलो छुटचीन Taq DNA पोलिमरेज, Qpcr, हाम्रो कम्पनीले प्रतिज्ञा गर्दछ: उचित मूल्यहरू, छोटो उत्पादन समय र सन्तोषजनक बिक्री पछि सेवा, हामी तपाईंलाई चाहेको कुनै पनि समयमा हाम्रो कारखाना भ्रमण गर्न स्वागत गर्दछौं।अब हामीसँग रमाइलो र दीर्घकालीन व्यापार होस् भन्ने कामना !!!
QuickEasyTM Cell Direct RT-qPCR Kit -Taqman
Cat.No.DRT-01021/01022
सेल प्रत्यक्ष RT-qPCR को लागि ≤ 1000,000 कक्षहरू प्रयोग गरेर
उत्पादन परिचय
यो उत्पादनले RT-qPCR प्रतिक्रियाहरूको लागि कल्चर्ड सेल नमूनाहरूबाट आरएनए द्रुत रूपमा रिलिज गर्नको लागि एक अद्वितीय lysis बफर प्रणाली प्रयोग गर्दछ, समय-खपत र श्रमिक RNA शुद्धिकरण प्रक्रियालाई हटाउँदै, र आवश्यक RNA टेम्प्लेट प्राप्त गर्न मात्र 7 मिनेट, 5× प्रत्यक्ष RT मिक्सको साथ, 2× प्रत्यक्ष qPCR Mix-Taquitman द्वारा द्रुत रूपमा उपलब्ध गराउने र वास्तविक समय-समयमा उपलब्ध गराइएको आरएनए टेम्प्लेट। परिणामहरू।
५× डाइरेक्ट आरटी मिक्स र २× डाइरेक्ट क्यूपीसीआर मिक्स-ताक्मानसँग बलियो अवरोधक सहिष्णुता छ र टेम्प्लेटको रूपमा मापन गर्न नमूनाको लाइसेट प्रयोग गरेर कुशल रिभर्सल र विशिष्ट प्रवर्धन गर्न सक्छ।अभिकर्मकले फोरजीन रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेज, हट डी-टाक डीएनए पोलिमरेज, डीएनटीपी, एमजीसीएल समावेश गर्दछ।2, प्रतिक्रिया बफर, PCR अप्टिमाइजर र स्टेबिलाइजर, जो lysis बफर संग प्रयोग गर्न सकिन्छ छिटो र सजिलै नमूना पत्ता लगाउन, र उच्च संवेदनशीलता, विशिष्टता र स्थिरता को विशेषताहरु छन्।
उत्पादन सुविधाहरू
सरल, प्रभावकारी Cell Direct RT प्रविधि जसले RNA नमूनाहरू प्राप्त गर्न 7 मिनेट जति थोरै लिन्छ।
नमूना आवश्यकताहरू सानो छन्, र प्रयोगको लागि न्यूनतम 10 कल्चर सेलहरू प्रयोग गर्न सकिन्छ।
384, 96, 24, 12, र 6-वेल प्लेटहरू जस्ता कल्चर्ड सेलहरूको द्रुत RNA अधिग्रहणको लागि उच्च थ्रुपुट।
DNA इरेजरले रिलिज गरिएका जीनोमहरू चाँडै हटाउन सक्षम छ, त्यसपछिको प्रयोगात्मक नतिजाहरूमा प्रभावलाई कम गर्छ।
अनुकूलित RT र qPCR प्रणालीहरूले अधिक कुशल रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन, विशिष्टता, र बलियो RT-qPCR प्रतिक्रिया अवरोध सहिष्णुताको साथ दुई-चरण RT-PCR सक्षम गर्दछ।
किट आवेदन
आवेदनको दायरा: सुसंस्कृत कक्षहरू।
नमूना लिसिस व्याख्या गरिएको आरएनए: दुई-चरण RT-qPCR टेम्प्लेटको रूपमा मात्र प्रयोग गरियो।
किटहरू निम्न उद्देश्यका लागि प्रयोग गर्न सकिन्छ: जीन नियामक अभिव्यक्ति विश्लेषण, एलेल परीक्षण, औषधि परीक्षण, आदि।
किट सीमितताहरू
एम्प्लीफाइड टुक्राहरू ≤ 300 bp।
किटहरू ताजा कल्चर कक्षहरू प्रयोग गरिन्छ।
उत्पादन गुणस्तर नियन्त्रण
FOREGENE को कुल गुणस्तर व्यवस्थापन प्रणाली अनुसार, किटहरूको प्रत्येक ब्याचको गुणस्तरको विश्वसनीयता र स्थिरता सुनिश्चित गर्न सेल डाइरेक्ट RT-qPCR श्रृंखला किटहरूको प्रत्येक ब्याचलाई धेरै पटक कडाईका साथ परीक्षण गरिन्छ।
किट सामग्री
| QuickEasyTM सेल प्रत्यक्ष RT-qPCR Kit-Taqman | ||||
| किट घटक २०μl qPCR प्रतिक्रिया प्रणाली | DRT-01021 | DRT-01022 | नोट | |
| २०० टि | १००० टि | |||
| भाग I | बफर CL | ४ मिलि | 20 मिलीलीटर |
सेल लाइसिस |
| फोरजीन प्रोटीज प्लस II | ८० μl | 400 μl | ||
| बफर ST | 400 μl | १ मिली × २ | ||
|
भाग II | डीएनए इरेजर | ८० μl | 400 μl | |
| ५ × प्रत्यक्ष आरटी मिक्स * | 160 μl | 800 μl | RT | |
| 2× प्रत्यक्ष qPCR मिक्स-ताकमान * | १ मिली × २ | १.७ मिली × ६ | qPCR | |
| 20×ROX सन्दर्भ डाई | 40 μl | 200 μl | ||
| RNase-मुक्त ddH2O | १.७ एमएल | १० एमएल | ||
| निर्देशन पुस्तिका | १ टुक्रा | १ टुक्रा | ||
*:सेल लाइसिस, 5×डायरेक्ट आरटी मिक्स, 2× डायरेक्ट क्यूपीसीआर मिक्स-टाक्मान अलग-अलग किन्न सकिन्छ, विवरणहरू परिशिष्ट 1 (पृष्ठ 13) मा प्रदान गरिएको छ।
भण्डारण अवस्थाहरू
1. ढुवानी सर्तहरू
कम तापक्रम आइस प्याक बक्स ढुवानीको सम्पूर्ण प्रक्रिया, किट <4 डिग्री सेल्सियस अवस्थामा छ भनी सुनिश्चित गर्न।
2. भण्डारण अवस्था
भाग I 4°C मा र भाग II -20°C मा भण्डार गर्नुहोस्।
Foregene Protease Plus II लाई 4°C मा भण्डारण गरिनु पर्छ, -20°C मा जमेको छैन।
Reagent 2× Direct qPCR Mix-Takman -20°C मा भण्डारण गरिन्छ, वा 4°C मा छोटो अवधिको प्रयोगको लागि यदि बारम्बार प्रयोग गरिन्छ (१० दिन भित्र)।
किट घटक जानकारी
बफर सीएल: सेल लाइसिस प्रतिक्रियाहरूको लागि आवश्यक वातावरण प्रदान गर्दछ।
बफर ST: पछिको RT मा प्रभावहरूबाट बच्नको लागि lysate मा सक्रिय पदार्थ समाप्त गर्दछ।
DNA इरेजर: DNA रिमूभर, पछिका प्रयोगहरूमा जीनोम हटाउने प्रभाव।
5× Direct RT मिक्स: उच्च RNA एफिनिटी फोरजीन रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेज, RNase अवरोधक, dNTPs, स्टेबिलाइजरहरू, एन्हान्सरहरू, अप्टिमाइजरहरू, र इष्टतम पङ्क्तिबद्धताका लागि रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन प्राइमरहरू समावेश गर्दछ (Random Primer, Oligo(dT)18प्राइमर)।
फोरेजीन प्रोटीज प्लस II: लाइसिस बफरको सन्दर्भमा, कोशिकाहरूलाई न्यूक्लिक एसिड रिलिज गर्नको लागि लिज गरिन्छ।
2× प्रत्यक्ष qPCR मिक्स-ताकमान: यो अभिकर्मकले तातो D-Taq DNA पोलिमरेज, dNTPs, MgCl समावेश गर्दछ।2, प्रतिक्रिया बफर, PCR अनुकूलक, र स्टेबलाइजर।
20× ROX सन्दर्भ डाई: सामान्यतया ABI, Stratagene र अन्य कम्पनीहरूको वास्तविक समय PCR प्रवर्द्धन उपकरणहरूमा प्रयोग गरिन्छ, यो PCR डोजिङ त्रुटिहरूको कारणले गर्दा PCR ट्यूबहरू र ट्यूबहरू बीचको भिन्नता समायोजन गर्न प्रयोग गरिन्छ।विभिन्न उपकरणहरूको लागि आवश्यक 20 × ROX सन्दर्भ डाई एकाग्रता फरक छ, र प्रयोगकर्ताले यसलाई उपकरणको सिफारिस गरिएको एकाग्रता अनुसार थप्न सक्छ।
RNase-मुक्त ddH2O: दुई-चरण RT-qPCR प्रतिक्रियाहरूको लागि RNase-मुक्त निर्जंतुक अल्ट्रा शुद्ध पानी।
सावधानी:(किट प्रयोग गर्नु अघि सावधानीहरू ध्यानपूर्वक पढ्न निश्चित हुनुहोस्)
नमूनाहरू बीच क्रस-प्रदूषणबाट बच्न प्रयोगको सञ्चालन विधिमा ध्यान दिनुहोस्।
प्रयोगात्मक वातावरण र भाँडाकुँडाहरूको सरसफाइमा ध्यान दिनुहोस् RNase प्रदूषण र RNA गिरावटबाट बच्न।
ताजा वा राम्ररी संरक्षित सेल नमूनाहरू लिनुहोस् र दोहोर्याइएको फ्रिज-थाउड सेल नमूनाहरू कहिल्यै प्रयोग नगर्नुहोस्।
5× Direct qPCR Mix, 2× Direct qPCR Mix-Takman दोहोरिने फ्रिज-थउबाट बच्नुपर्छ, अन्यथा यसले रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन र PCR दक्षतालाई असर गर्नेछ।
तयारीराशनपहिलेसञ्चालन
यो किट प्रयोग गर्नु अघि निर्देशनहरू सावधानीपूर्वक पढ्न निश्चित हुनुहोस्।सेल डाइरेक्ट RT-qPCR किट सरल, सुविधाजनक र छिटो सञ्चालनमा छ, र निर्देशनहरूले सम्पूर्ण किट र यसलाई कसरी सही रूपमा प्रयोग गर्ने बारे पूर्ण जानकारी प्रदान गर्दछ।कृपया प्रयोग गर्नु अघि आवश्यक प्रयोगात्मक सामग्री र उपकरणहरू तयार गर्नुहोस्।
प्रयोगात्मक सामग्री र उपकरण
◆ संस्कृति कक्षहरू।
◆ 1.5 ml वा 2 ml, RNase-/DNase-मुक्त सेन्ट्रीफ्यूज ट्यूब, RNase-/DNase-मुक्त टिप, 0.2 ml बाँझ qPCR ट्यूब।
◆ qPCR मेसिन, पिपेट, टेबलटप सेन्ट्रीफ्यूज (≥१३,४००×g) (प्रयोगात्मक आवश्यकताहरूमा निर्भर गर्दै), आदि।
सुरक्षा
◆ यो उत्पादन वैज्ञानिक अनुसन्धान उद्देश्यका लागि मात्र हो, कृपया यसलाई औषधि, क्लिनिकल, खाना र कस्मेटिक उद्देश्यका लागि प्रयोग नगर्नुहोस्।
◆ रसायन प्रयोग गर्दा उपयुक्त ल्याब कपडा, पन्जा, सुरक्षात्मक चश्मा आदि लगाउनुहोस्।
सञ्चालनगाइडहरू
सेल लाइसिस प्रणालीहरू, RT प्रणालीहरू, र qPCR प्रतिक्रिया समाधान पूरक प्याकहरू परिशिष्ट 1 (पृष्ठ 13) मा विवरणहरूको लागि छुट्टै खरिद गर्न सकिन्छ।
सञ्चालन गाइड
A: नमूना आरएनए रिलीज
1. कक्षहरू पूर्व-उपचार गरिएका थिए: कोशिका कल्चर प्लेटलाई चिसो पीबीएसले धुनुहोस्, त्यसपछि कोशिकाहरूलाई लिज गर्नुहोस् (१०-१०6), १०6 कोशिकाहरूको मात्रा भन्दा, आरएनए निकासी र शुद्धीकरणको लागि फोरजीन सेल एक आरएनए आइसोलेशन किट टोटल (DE-03111) वा एनिमल टोटल आरएनए आइसोलेशन किट (DE-03011) सिफारिस गरिन्छ।
१.१।अनुयायी कक्षहरू (24- राम्रो प्लेट उदाहरणको रूपमा)
१.१.१।प्रत्येक कुवामा कक्षहरूको संख्या निर्धारण गर्नुहोस्, कक्षहरूको संख्या 1 × 10 हो भनेर निर्धारण गर्नुहोस्5, र संस्कृति डिशबाट संस्कृति माध्यम हटाउन पिपेट प्रयोग गर्नुहोस्।
१.१.२।प्रत्येक कुवामा 200 μl पूर्व-चिल्ड 1 × PBS थप्नुहोस्।बारम्बार पाइपिङ नगर्नुहोस् र इनारबाट PBS हटाउनुहोस्।प्लेट झुकाउनुहोस् र सकेसम्म धेरै PBS हटाउनुहोस्।चरण 2 मा अगाडि बढ्नुहोस्।
१.१.३।सेल कल्चर डिशमा विभिन्न सेल कल्चर डिश वा सन्दर्भ नम्बर तालिका 1-1 सेल धुनेको लागि पूर्व कूल 1 × PBS थपिएको थियो।
तालिका1-1: कक्षहरूको विभिन्न संख्याहरूको लागि PBS खुराक
| संस्कृति प्लेट प्रकार | कक्षहरूको संख्या / राम्रो | 1 × PBS/ राम्रो |
| 6-राम्रो | १ × १०6 | 1000 μl |
| 12-राम्रो | २ × १०5 | 400 μl |
| 24-राम्रो | 105 | 200 μl |
| 96-राम्रो | 104 | ५० μl |
| ३८४-राम्रो | ५ × १०3 | २५ μl |
नोट:एक फर्म अनुयायी कक्षहरू सुनिश्चित गर्न,धुँदा ठूलो संख्यामा कोशिका हानि हुनबाट जोगियो।
१.२।निलम्बन कक्षहरू वा गैर-छिद्र प्लेटहरूमा संवर्धित अनुयायी कक्षहरू
१.२.१।गैर-मल्टी वेल प्लेटहरू (निलम्बन कक्षहरू अर्को चरण 1.2.2 बाट सुरु हुन्छ), कोषहरूलाई सङ्कलन गर्ने र सामान्य सेल सङ्कलन विधि अनुसार अलग गर्ने, र तिनीहरूलाई कल्चर प्लेट वा सेन्ट्रीफ्यूज ट्यूबमा राख्ने;यदि ट्रिप्सिनाइजेशन प्रयोग गरिएको छ भने, कोशिकाहरू सङ्कलन गर्न र अवशिष्ट ट्रिप्सिन हटाउन सेन्ट्रीफ्यूगेशन आवश्यक पर्दछ, कोशिकाहरूलाई फैलाउनको लागि व्यक्तिगत कक्षहरूमा PBS पुन: सस्पेन्डेड कक्षहरू थपियो।
१.२.२।कक्षहरूको संख्या गणना पछि, 1 × 10 कोशिकाहरू aliquoted5 सेन्ट्रीफ्यूज ट्यूबहरूमा एक, १० मिनेटको लागि 1000 × g मा सेन्ट्रीफ्यूगेशन द्वारा सेलहरू सङ्कलन गर्नुहोस्।
१.२.३।सेन्ट्रीफ्यूज ट्यूबमा 200 μl PBS थप्नुहोस्, बारम्बार पाइपेट नगर्नुहोस्, र PBS लाई सीधै एस्पिरेट गर्नुहोस्।चरण 2 मा अगाडि बढ्नुहोस्। (यदि अवक्षेपण गर्न गाह्रो छ र कोशिकाहरू पुन: निलम्बन गरिएको छ भने, 1000×g सेन्ट्रीफ्यूज गर्न सकिन्छ 10 मिनेट सुपरनेट्यान्ट खारेज पछि, सेल गोली चरण 2 मा अगाडि बढ्नुहोस्)
2. सेल lysis: निम्न तालिका 1-2 तयार lysis प्रणाली अनुसार, Buffer CL हटाउनुहोस्, यसको तापक्रम कोठाको तापक्रममा सन्तुलित, DNA इरेजर र Foregene Protease Plus II: (Lysis समाधान प्रयोगको लागि तयार छ)।
तालिका 1-2: क्लीभेज प्रणाली तयारी (नोट: बर्फ मा तयारी मा)
| कम्पोनेन्ट (सेल लाइसिस मास्टर मिक्स) | 6 राम्रो प्लेट | 12- राम्रो प्लेट | 24- राम्रो प्लेट | 96- राम्रो प्लेट | 384- राम्रो प्लेट |
| 1000 μl / राम्रो | 400 μl/राम्रो | 200 μl / राम्रो | 50 μl/राम्रो | 25 μl/राम्रो | |
| बफर CL | 960μl | 384μl | 192μl | 48μl | 24μl |
| डीएनए इरेजर | 20μl | 8μl | 4μl | 1μl | ०.५ μl |
| फोरजीन प्रोटीज प्लस II | 20μl | 8μl | 4μl | १ μl | ०.५ μl |
3.( उदाहरणको रूपमा 24-वेल प्लेट) प्रत्येक इनारमा सेल लाइसिस मास्टरको 200 μl पिपेट मिसाउनुहोस्, 5-10 पटक दोहोर्याउनुहोस्, 5 मिनेटको लागि कोठाको तापक्रम (20-25 ℃) मा इन्क्युबेट गर्नुहोस्।
नोट:बुलबुलेको गठनबाट बच्नको लागि, कृपया पाइपिङ पिपेट स्केल 200μl वा कममा समायोजन गर्दा।कोशिकाहरू lysis पछि बादल देखिन सक्छ, जुन सामान्य हो।
4. (उदाहरणका लागि 24 - राम्रो प्लेट) तरल 20 μl बफर ST मा थपिएको छ (तालिका 1-3 मा देखाइएको मात्रामा विभिन्न lysis प्रणालीहरू बफर ST थपिएको छ), 5-10 पटक दोहोर्याइएको पाइपिङ, कोठाको तापक्रममा (20-25 ℃) 2 मिनेटको लागि इन्क्युबेट गरिएको थियो।
नोट:पिपेट टिप सतह मुनि डिस्पोज गरियो, लाइसेट थपिएको सुनिश्चित गर्दै,बुलबुलेको गठनबाट बच्नको लागि, कृपया जब पाइपिङ पिपेट स्केल 200μl वा कममा समायोजित गरियो।
तालिका १-३:बफर ST थप्नुहोस्
| बफर ST | 6- राम्रो प्लेट | 12- राम्रो प्लेट | 24- राम्रो प्लेट | 96- राम्रो प्लेट | 384- राम्रो प्लेट |
| 100 μl/राम्रो | 40 μl/राम्रो | 20 μl/राम्रो | 5 μl/राम्रो | 2.5 μl / राम्रो |
5. लाइसेट पछिको RT-qPCR प्रयोगहरूको लागि प्रयोग गरिन्छ।यदि त्यसपछिका प्रयोगहरू समयमा गर्न सकिँदैन भने, कृपया यसलाई 2 घण्टा भन्दा बढीको लागि बरफमा राख्नुहोस्, र -20 ℃ वा -80 ℃ (तीन महिना भन्दा बढी) मा भण्डार गर्नुहोस्।
B: RT प्रणाली तयारी
1. 5 × प्रत्यक्ष RT मिक्स निकाल्नुहोस् र यसलाई आइस बाथमा राख्नुहोस्, यसलाई प्राकृतिक रूपमा पग्लन दिनुहोस्, र पछि प्रयोगको लागि बिस्तारै मिलाउनुहोस्;RNase-Free ddH2O बाहिर निकाल्नुहोस् र यसलाई पिघल्नुहोस् र पछि प्रयोगको लागि आइस बाथमा राख्नुहोस्।तलको तालिका २-१ अनुसार बरफमा प्रतिक्रिया प्रणाली तयार गर्नुहोस्।
तालिका २-१: RT प्रतिक्रिया प्रणालीको तयारी
| RT प्रणाली सामग्री थप्नुहोस् | रकम संग | अन्तिम एकाग्रता | |
| 5 × प्रत्यक्ष RT मिक्स | 4μl | ८ μl | १ × |
| सेल लाइसेट्स (आरएनए टेम्प्लेट) | ४ μl | ८ μl | दायरा समायोजन थप्नुहोस् (१० -४०%) |
| RNase-मुक्त ddH2O | 12 μl | 24 μl | - |
| कुल मात्रा | २० μl | 40 μl | - |
2. प्रणाली ढाँचा पूरा गरेपछि, निम्न तालिकामा हल्का रूपमा मिश्रित र सेन्ट्रीफ्यूज गरिएको छ 2 -2 प्रतिक्रिया अवस्थाहरू RT प्रतिक्रिया।
तालिका 2-2: RT प्रतिक्रिया अवस्था सेटिङ
| चरण | तापक्रम | समय | सामग्री |
| 1 | ४२ डिग्री सेल्सियस | १५-३० मिनेट | cDNA संश्लेषण |
| 2 | ९५ डिग्री सेल्सियस | ५ मिनेट | निष्क्रिय रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेज |
| 3 | ४ डिग्री सेल्सियस | N/A |
3. प्रतिक्रिया पूरा भएपछि, प्रतिक्रिया उत्पादन qPCR को लागि सिधै बरफमा राखिएको थियो, कृपया दीर्घकालीन संरक्षण -20 ℃ वा -80 ℃ राख्नुहोस्।
नोट: गैर-शुद्ध टेम्प्लेटको प्रयोगको कारण, उल्टो ट्रान्सक्रिप्शन उत्पादनमा सेतो अवक्षेपण देखा पर्न सक्छ।यो एक सामान्य घटना हो।त्यसपछिका प्रयोगहरूको लागि तुरुन्तै सुपरनेटेन्ट सेन्ट्रीफ्यूज गर्नुहोस्।
परिणामस्वरूप RT प्रतिक्रिया समाधान अर्को चरण वास्तविक समय PCR प्रतिक्रिया प्रणालीहरूमा थपिएको छ, यो प्रतिक्रिया प्रणालीको 10-30% सम्मको मात्रा थप्न सिफारिस गरिन्छ।
C: qPCR प्रतिक्रिया प्रणाली तयारी
1. प्रतिक्रिया प्रणाली तयार गर्न निम्न तालिका 3-1 अनुसार चरण cDNA टेम्प्लेटमा तयार B को उपयुक्त मात्रा।
नोट: cDNA टेम्प्लेटको रकम qPCR प्रणालीको १०-३०% हो।उदाहरणका लागि, 20μl qPCR प्रणालीमा, 2-6 μl lysis बफर थप्नुहोस्, तर 6 μl भन्दा बढी होइन।
2. qPCR प्रतिक्रियाको लागि अप्टिमाइजेसन राम्रो qPCR सर्तहरू (एनीलिङ तापमान, आदि) (तालिका 3-2 मा दिइएको प्रतिक्रिया अवस्थाहरू)।
नोट: राम्रो परिणामहरू प्राप्त गर्न qPCR प्रतिक्रियाहरूको लागि अनुकूलित अवस्थाहरू प्रयोग गर्ने प्रयास गर्नुहोस्।
तालिका ३-१: PCR प्रतिक्रिया प्रणालीको तयारी
| RT प्रणाली सामग्री थप्नुहोस् | रकम संग | अन्तिम एकाग्रता |
| 2× प्रत्यक्ष qPCR मिक्स-Takman | १० μl | १× |
| अगाडि प्राइमर (10μM) | ०.४ μl | ५०-९०० एनएम १* |
| उल्टो प्राइमर (10μM) | ०.४ μl | ५०-९०० एनएम १* |
| प्रोब(10μM) | ०.२ μl | 200nM |
| cDNA टेम्प्लेट (चरण B मा प्राप्त) | ४ μl | 10-30% |
| RNase-मुक्त ddH2O | - | |
| 20×ROX सन्दर्भ डाई 3* | - | - |
| कुल मात्रा | २० μl |
1*: प्राइमर प्रतिक्रिया प्रदर्शन खराब हुँदा प्राइमर एकाग्रता 50-900 nM को दायरामा समायोजित गर्न सकिन्छ।
नोट: qPCR प्रणाली प्रयोगात्मक आवश्यकता र फ्लोरोसेन्स साइकल मोडेल अनुसार समायोजित गर्न सकिन्छ।50 मा qPCR को लागीμl प्रणाली, 20 अनुसार समानुपातिक रूपमा अभिकर्मक खुराक समायोजन गर्नुहोस्μl प्रणाली।
| वास्तविक समय पीसीआर मेसिन | ROX सन्दर्भ डाई अन्तिम एकाग्रता |
| ABI PRISM7000/7300/7700/7900HT/स्टेप वन, आदि। | 1×(जस्तै 20 μl प्रणाली, 1 μl 20×ROX सन्दर्भ डाई थप्नुहोस्) |
| ABI 7500/7500 फास्ट र StratageneMx3000P/Mx3005P/Mx4000, आदि। | ०.५ × (जस्तै 20 μl प्रणाली, 0.5 μl 20 × ROX सन्दर्भ डाई थप्नुहोस्) |
2*: फ्लोरोसेन्स मात्रात्मक थर्मल साइक्लर अनुसार ROX सन्दर्भ डाईको उपयुक्त अन्तिम एकाग्रता चयन गर्नुहोस्।सामान्य फ्लोरोसेन्स मात्रात्मक साइकलहरूको लागि सबैभन्दा उपयुक्त ROX सन्दर्भ डाई सांद्रता तलको तालिकामा देखाइएको छ:
तालिका ३-२: qPCR प्रतिक्रिया अवस्थाहरू प्रदान गरिएको छ
| दुई-चरण | तापक्रम | समय | साइकलहरू | सामग्री |
| 1 | 95 ℃ | ३ मिनेट | 1 | पूर्वनिर्धारण |
| 2 | 95 ℃ | ५-१० सेकेन्ड | 40 | टेम्प्लेट विकृतीकरण |
| 3 | ६०-६५ ℃ | २०-३० सेकेन्ड | एनिलिङ / विस्तार |
नोट: उत्कृष्ट qPCR प्रभाव प्राप्त गर्नको लागि, ग्रेडियन्ट PCR विभिन्न टेम्प्लेटहरू र विभिन्न प्राइमरहरूको लागि प्रतिक्रिया अवस्थाहरू अनुकूलन गर्न प्रयोग गर्न सकिन्छ।PCR प्रतिक्रिया अवस्थाहरू फ्लोरोसेन्स विश्लेषक, टेम्प्लेट, प्राइमर, इत्यादिको आधारमा भिन्न हुन्छन्। विशिष्ट कार्यमा, इष्टतम प्रतिक्रिया अवस्थाहरू फ्लोरोसेन्स मात्रात्मक थर्मल साइक्लर, टेम्प्लेट प्रकार, रुचिको टुक्राको आकार, एम्प्लीफाइड सामग्रीको आधार अनुक्रम, प्रवर्धित सामग्रीको लम्बाइ, तापक्रम खण्ड र प्राइमर प्रतिक्रियाको लम्बाइ, आदि।
वास्तविक समय पीसीआर प्राइमर डिजाइन सिद्धान्तहरू
फर्वार्ड प्राइमर र रिभर्स प्राइमर
वास्तविक समय पीसीआर को लागी, प्राइमर डिजाइन धेरै महत्त्वपूर्ण छ।प्राइमरहरू PCR प्रवर्धनको विशिष्टता र दक्षतासँग सम्बन्धित छन्, र निम्न सिद्धान्तहरूको सन्दर्भमा डिजाइन गर्न सकिन्छ:
◆ प्राइमर लम्बाइ: 18-30bp।
◆ GC सामग्री: 40-60%।
◆ Tm मान: प्राइमर डिजाइन सफ्टवेयर, जस्तै प्राइमर 5, ले प्राइमरको Tm मान दिन सक्छ।अपस्ट्रिम र डाउनस्ट्रीम प्राइमरहरूको Tm मानहरू सकेसम्म नजिक हुनुपर्छ।Tm गणना सूत्र पनि प्रयोग गर्न सकिन्छ: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T)।PCR प्रदर्शन गर्दा, 5 °C को प्राइमर Tm मान भन्दा कम तापमान सामान्यतया annealing तापमान को रूप मा चयन गरिन्छ (annealing तापमान मा समान वृद्धि PCR प्रतिक्रिया को विशिष्टता बढाउन सक्छ)।
◆ प्राइमर र PCR उत्पादनहरू:
◆ डिजाइन प्राइमर PCR प्रवर्द्धन उत्पादन लम्बाइ प्राथमिकतामा 100-150bp छ।
◆ टेम्प्लेटको माध्यमिक संरचनात्मक क्षेत्रमा डिजाइन प्राइमरहरू सकेसम्म बेवास्ता गर्नुपर्छ।
◆ अपस्ट्रिम र डाउनस्ट्रीम प्राइमरहरूको 3′ छेउहरू बीच 2 वा बढी पूरक आधारहरूको गठनबाट बच्न।
◆ प्राइमर 3′ टर्मिनल आधार 3 अतिरिक्त लगातार G वा C संग उपस्थित हुन सक्दैन।
◆ प्राइमरहरू आफैंमा पूरक संरचनाहरू हुन सक्दैनन्, अन्यथा हेयरपिन संरचना बनाइनेछ, जसले PCR प्रवर्धनलाई असर गर्छ।
◆ ATCG लाई प्राइमर अनुक्रममा सकेसम्म समान रूपमा वितरण गरिनुपर्छ, र 3′ टर्मिनल आधारलाई T को रूपमा बेवास्ता गर्नुपर्छ।
परिशिष्ट1:Cप्रत्यक्षRT-qPCR किट घटकt पूरक प्याक
1. सेल लाइसिस समाधान
|
| |||
| किट अवयवहरू (24-वेल लिसिस प्रणाली / राम्रो) | DRT-01011-A1 | DRT-01011-A2 | |
| १०० टि | ५०० टि | ||
| भागम | बफर CL | 20 मिलीलीटर | 100 मिलीलीटर |
| फोरजीन प्रोटीज प्लस II | 400 μl | १ मिली × २ | |
| बफर ST | १ मिली × २ | १० एमएल | |
| भागII | डीएनए इरेजर | 400 μl | १ मिली × २ |
|
| |
| किट अवयवहरू (20 μl प्रतिक्रिया प्रणाली) | DRT-01011-B1 |
| २०० टि | |
| 5× प्रत्यक्ष RT मिक्स | 800 μl |
| RNase-मुक्त ddH2O | १.७ मिली × २ |
3.qPCR मिक्स
|
| ||
| किट अवयवहरू (20 μl प्रतिक्रिया प्रणाली) | DRT-01021-C1 | DRT-01021-C2 |
| २०० टि | १००० टि | |
| 2× प्रत्यक्ष qPCR मिक्स-Takman | १ मिली × २ | १.७ मिली × ६ |
| 20× ROX सन्दर्भ डाई | 40 μl | 200 μl |
| RNase-मुक्त ddH2O | १.७ एमएल | १० एमएल |
विश्वको फोरजीन
Foregene Co., Ltd
टेलिफोन: ०२८-८३३६०२५७,०२८-८३३६१२५७
E-mail ：info@foregene.com
http://www.foregene.com
