पिपेट टिपहरू र EP ट्यूबहरू, आदिको नसबंदी।

1. 0.1% (एक हजारौं) DEPC (अत्यधिक विषाक्त पदार्थ) डिआयोनाइज्ड पानीसँग तयार पार्नुहोस्, यसलाई धुवाँ हुडमा सावधानीपूर्वक प्रयोग गर्नुहोस्, र यसलाई प्रकाशबाट 4 डिग्री सेल्सियसमा भण्डार गर्नुहोस्;

DEPC पानी शुद्ध पानी हो जुन DEPC बाट प्रशोधन गरिन्छ र उच्च तापक्रम र उच्च चापबाट निर्जंतुक गरिन्छ।RNase, DNase र proteinase मुक्त हुन परीक्षण।

2. पिपेट टिप र EP ट्यूबलाई ०.१% DEPC मा राख्नुहोस्, र पिपेट टिप र EP ट्यूब ०.१% DEP भरिएको सुनिश्चित गर्नुहोस्।

3. उज्यालोबाट जोगाउनुहोस्, खडा हुन दिनुहोस्, रातभर (१२-२४ घण्टा)

4. टिप र EP ट्यूब भएको बक्सलाई DEPC मा भिजाउनु पर्दैन।टिप वा EP ट्युबमा DEPC पानी लगभग हटाएर, यसलाई प्याक गर्नुहोस् र यसलाई बेर्नुहोस्।

5. 121 डिग्री सेल्सियस, 30 मिनेट

6. 180 डिग्री सेल्सियस, धेरै घण्टाको लागि सुख्खा (कम्तीमा 3 घण्टा)

नोट: क.DEPC ह्यान्डल गर्दा लेटेक्स पन्जा र मास्क लगाउनुहोस्!b, वा DEPC नसबंदी बिना, 130 ℃, 90min अटोक्लेभ (धेरै प्रयोगशालाहरू उच्च तापमान दुई पटक नसबंदी)

आरएनए निकासी विचारहरू

ऊतक आरएनए अलगाव विफलता को दुई प्रमुख घटना

आरएनए क्षरण र तन्तुहरुमा अशुद्धता को अवशेष,डिग्रेडेसनको सन्दर्भमा, पहिले कल्चर्ड कोशिकाहरूबाट निकालिएको आरएनए किन सजिलै घट्दैन भनेर हेरौं।अवस्थित आरएनए निकासी अभिकर्मकहरूले सबै कम्पोनेन्टहरू समावेश गर्दछ जुन द्रुत रूपमा RNase रोक्छ।कल्चर गरिएको कोशिकाहरूमा लाइसेट थप्नुहोस्, र यसलाई मिलाउनुहोस्, सबै कोशिकाहरू लाइसेटसँग राम्ररी मिलाउन सकिन्छ, र कोशिकाहरू पूर्ण रूपमा लाइसेड हुन्छन्।कोशिकाहरू लाइज गरिसकेपछि, लाइसेटमा सक्रिय अवयवहरूले तुरुन्तै इन्ट्रासेलुलर RNase लाई रोक्छ, त्यसैले RNA अक्षुण्ण रहन्छ।अर्थात्, कल्चर गरिएका कोशिकाहरू सजिलैसँग र लाइसेटसँग पूर्ण रूपमा सम्पर्क भएका हुनाले तिनीहरूको आरएनए सजिलै घट्दैन;अर्कोतर्फ, तन्तुमा रहेको आरएनए सजिलैसँग बिग्रेको छ किनभने तन्तुका कोशिकाहरूलाई लाइसेटसँग छिटो सम्पर्क गर्न सजिलो हुँदैन।पर्याप्त सम्पर्कको कारण।तर,आरएनए गतिविधिलाई रोक्ने क्रममा तन्तुलाई एउटै कोशिकामा परिणत गर्ने तरिका छ भनी मानेर, क्षयको समस्या पूर्ण रूपमा समाधान गर्न सकिन्छ।

तरल नाइट्रोजन मिलिङ सबैभन्दा प्रभावकारी यस्तो विधि हो।जे होस्, तरल नाइट्रोजन मिलिङ विधि धेरै परेशानी छ, विशेष गरी जब नमूनाहरूको संख्या ठूलो छ।यसले अर्को सबैभन्दा राम्रो कुरालाई जन्म दियो: homogenizer।दhomogenizerविधिले कोशिकाहरूलाई लाइसेटसँग सम्पर्क गर्नु अघि RNase गतिविधि कसरी रोकिन्छ भन्ने प्रश्नलाई विचार गर्दैन, बरु इन्ट्रासेलुलर RNase RN लाई घटाउने दर भन्दा टिस्यु अवरोधको दर छिटो होस् भनेर प्रार्थना गर्दछ।

इलेक्ट्रिक homogenizer को प्रभाव राम्रो छ,र गिलास होमोजेनाइजरको प्रभाव कमजोर छ, तर सामान्यतया, होमोजेनाइजर विधिले गिरावटको घटनालाई रोक्न सक्दैन।तसर्थ, यदि निकासी घटाइएको छ भने, तरल नाइट्रोजनको साथ पीस गर्नको लागि मूल इलेक्ट्रिक होमोजेनाइजर प्रयोग गर्नुपर्छ;मूल गिलास होमोजेनाइजरलाई इलेक्ट्रिक होमोजेनाइजरमा परिवर्तन गर्नुपर्छ वा सीधा तरल नाइट्रोजनको साथ मिलाइन्छ।समस्या लगभग 100% सम्भव छ।समाधान होस्।

पछिल्ला प्रयोगहरूलाई असर गर्ने अशुद्धता अवशेष समस्याको क्षय भन्दा धेरै विविध कारणहरू छन्, र समाधानहरू समान रूपमा फरक छन्।निश्कर्षमा,यदि टिश्युमा क्षय वा अवशिष्ट अशुद्धताहरू छन् भने, विशिष्ट प्रयोगात्मक सामग्रीको लागि निकासी विधि/अभिकर्मक अनुकूलित हुनुपर्छ।तपाईंले अप्टिमाइजेसनको लागि आफ्नो बहुमूल्य नमूनाहरू प्रयोग गर्नु पर्दैन: तपाईंले बजारबाट माछा/कुखुरा जस्ता केही साना जनावरहरू किन्न सक्नुहुन्छ, RNA निकासीका लागि सामग्रीको सम्बन्धित भाग लिन सक्नुहुन्छ, र प्रोटीन निकासीका लागि अर्को भाग - मुख, पेट र आन्द्राहरू निकासीले पीस्नुहोस्।

निकालिएको RNA को लक्ष्य RNA विभिन्न फलो-अप प्रयोगहरूको लागि प्रयोग गरिन्छ, र यसको गुणस्तर आवश्यकताहरू फरक छन्।

सीडीएनए पुस्तकालय निर्माणलाई इन्जाइम प्रतिक्रिया अवरोधकहरूको अवशेष बिना आरएनए अखण्डता चाहिन्छ;उत्तरीलाई उच्च आरएनए अखण्डता र इन्जाइम प्रतिक्रिया अवरोधक अवशेषहरूका लागि कम आवश्यकताहरू चाहिन्छ;RT-PCR लाई धेरै उच्च आरएनए अखण्डता आवश्यक पर्दैन,तर इन्जाइम प्रतिक्रियाहरूलाई रोक्छ।अवशिष्ट आवश्यकताहरू कडा छन्।इनपुटले आउटपुट निर्धारण गर्दछ;हरेक पटक लक्ष्य उच्चतम शुद्धता RNA प्राप्त गर्ने हो, यो जनता र पैसा खर्च हुनेछ।

नमूनाहरूको सङ्कलन/भण्डारण

ह्रासलाई असर गर्ने कारकहरू नमूनाले जीवित शरीर/वा मूल वृद्धि वातावरण छोडेपछि, नमूनामा अन्तर्जात इन्जाइमहरूले आरएनएलाई घटाउन थाल्छ,र गिरावट दर अन्तर्जात इन्जाइम र तापमान को सामग्री संग सम्बन्धित छ।परम्परागत रूपमा, अन्तर्जात इन्जाइम गतिविधिलाई पूर्ण रूपमा रोक्न दुईवटा तरिकाहरू छन्: तुरुन्तै लाइसेट थप्नुहोस् र राम्ररी र छिटो एकरूपता गर्नुहोस्;सानो टुक्रामा काट्नुहोस् र तुरुन्तै तरल नाइट्रोजनमा फ्रिज गर्नुहोस्।दुबै दृष्टिकोणहरू छिटो सञ्चालन चाहिन्छ।पछिल्लो सबै नमूनाहरूको लागि उपयुक्त छ, जबकि पहिले कोशिकाहरू र अन्तर्जात इन्जाइमहरूको कम सामग्री भएका तन्तुहरूको लागि मात्र उपयुक्त छ र एकरूपता गर्न सजिलो छ।विशेष गरी, बिरुवाको तन्तु, कलेजो, थाइमस, प्यान्क्रियाज, प्लीहा, मस्तिष्क, बोसो, मांसपेशी तन्तु, आदिलाई अगाडि बढ्नु अघि तरल नाइट्रोजनको साथ राम्रोसँग जम्मा गरिन्छ।

नमूनाहरूको विखंडन र एकरूपता

क्षरण र उपज नमूना विखंडनलाई असर गर्ने कारकहरूपूर्ण homogenization को लागी, जुन आरएनए को पूर्ण र पूर्ण रिलीज को लागी हो।सेलहरू भाँचिएको बिना सीधा एकरूप हुन सक्छ।टिस्युहरू भाँचिएपछि मात्र एकरूप हुन सक्छ।खमीर र ब्याक्टेरियालाई एकरूपता बनाउनु अघि सम्बन्धित इन्जाइमहरूसँग तोड्न आवश्यक छ।तल्लो अन्तर्जात इन्जाइम सामग्री र सजिलो होमोजेनाइजेसन भएका तन्तुहरूलाई होमोजेनाइजरद्वारा लाइसेटमा एकै पटक कुचल र एकरूपता गर्न सकिन्छ;बिरुवाको तन्तु, कलेजो, थाइमस, प्यान्क्रियाज, प्लीहा, मस्तिष्क, बोसो, मांसपेशी तन्तु र अन्य नमूनाहरू, तिनीहरू या त अन्तर्जात इन्जाइमहरूमा उच्च हुन्छन् वा सजिलै संग एकरूप हुँदैनन्,त्यसैले ऊतक अवरोध र homogenization अलग प्रदर्शन गर्नुपर्छ।खण्डीकरणको सबैभन्दा भरपर्दो र उत्पादक विधि तरल नाइट्रोजनको साथ मिलिङ हो, र एकरूपताको सबैभन्दा भरपर्दो विधि इलेक्ट्रिक होमोजेनाइजरको प्रयोग हो।तरल नाइट्रोजन संग मिलिंग को बारे मा एक विशेष नोट: सम्पूर्ण मिलिंग प्रक्रिया को समयमा नमूना पगाल्नु हुँदैन, किनकि एन्डोजेनस इन्जाइमहरू जम्मा हुँदा काम गर्ने सम्भावना बढी हुन्छ।

lysate को छनोट

सञ्चालनको सुविधा र अवशिष्ट अंतर्जात अशुद्धताका कारकहरूलाई असर गर्ने सामान्यतया प्रयोग हुने lysis समाधानहरूले लगभग RNase को गतिविधिलाई रोक्न सक्छ।तसर्थ, लिसिस समाधान छनौट गर्ने मुख्य बिन्दु शुद्धिकरण विधिको साथ संयोजनमा विचार गर्नु हो।त्यहाँ एउटा अपवाद छ:उच्च अन्तर्जात इन्जाइम सामग्री भएका नमूनाहरूलाई अन्तर्जात इन्जाइमहरू निष्क्रिय गर्ने क्षमता बढाउन फिनोल युक्त लाइसेट प्रयोग गर्न सिफारिस गरिन्छ।

शुद्धीकरण विधि को छनौट

अवशिष्ट अंतर्जात अशुद्धतालाई असर गर्ने कारकहरू, निकासी गति सफा नमूनाहरू जस्तै कोशिकाहरूका लागि, सन्तोषजनक परिणामहरू हातमा लगभग कुनै पनि शुद्धिकरण विधिबाट प्राप्त गर्न सकिन्छ।तर धेरै अन्य नमूनाहरूका लागि, विशेष गरी ती बिरुवाहरू, कलेजो, ब्याक्टेरिया, आदि जस्ता उच्च स्तरको अशुद्धता भएकाहरूका लागि उपयुक्त शुद्धिकरण विधि छनोट गर्नु महत्त्वपूर्ण छ।स्तम्भ केन्द्रापसारक शुद्धिकरण विधिमा द्रुत निकासी गति छ र यसले प्रभावकारी रूपमा अशुद्धताहरू हटाउन सक्छ जसले आरएनएको पछिल्लो इन्जाइम्याटिक प्रतिक्रियालाई असर गर्छ, तर यो महँगो छ (फोरजीनले लागत-प्रभावी किटहरू प्रस्ताव गर्न सक्छ, थप विवरणहरू क्लिक गर्नुहोस्।यहाँ);किफायती र क्लासिक शुद्धिकरण विधिहरू प्रयोग गरेर, जस्तै LiCl वर्षाले पनि सन्तोषजनक परिणामहरू प्राप्त गर्न सक्छ, तर सञ्चालन समय लामो छ।।

आरएनए निकासीको लागि "तीन अनुशासन र आठ ध्यान"

अनुशासन १:एक्सोजेनस इन्जाइमहरूको प्रदूषणको अन्त्य गर्नुहोस्।

नोट १:कडाईका साथ मास्क र पन्जा लगाउनुहोस्।

नोट २:प्रयोगमा संलग्न सेन्ट्रीफ्यूज ट्यूबहरू, टिप हेडहरू, पिपेट रडहरू, इलेक्ट्रोफोरेसिस ट्याङ्कहरू, र प्रयोगात्मक बेन्चहरू राम्ररी डिस्पोज गर्नुपर्छ।

नोट ३:प्रयोगमा संलग्न अभिकर्मक/समाधानहरू, विशेष गरी पानी, RNase-रहित हुनुपर्छ।

अनुशासन २:अन्तर्जात इन्जाइमहरूको गतिविधि रोक्नुहोस्

नोट ४:उपयुक्त homogenization विधि छान्नुहोस्।

नोट ५:उपयुक्त lysate छान्नुहोस्।

नोट ६:नमूनाको सुरुवात मात्रा नियन्त्रण गर्नुहोस्।

अनुशासन ३:आफ्नो निकासी उद्देश्य स्पष्ट गर्नुहोस्

नोट ७:कुनै पनि lysate प्रणाली नमूनाको अधिकतम प्रारम्भिक मात्रामा पुग्दा, निष्कर्षण सफलता दर तीव्र रूपमा घट्छ।

नोट ८:सफल आरएनए निकासीको लागि एक मात्र आर्थिक मापदण्ड पछिका प्रयोगहरूमा सफलता हो, उपज होइन।

RNase प्रदूषणका शीर्ष 10 स्रोतहरू

1. औंलाहरू एक्सोजेनस इन्जाइमहरूको पहिलो स्रोत हुन्, त्यसैले पन्जाहरू लगाउनु पर्छ र बारम्बार बदल्नुपर्छ।यसको अतिरिक्त, मास्क पनि लगाउनु पर्छ, किनभने सास फेर्न पनि इन्जाइमहरूको महत्त्वपूर्ण स्रोत हो।ग्लोभ मास्क लगाउनुको थप फाइदा भनेको प्रयोगकर्तालाई बचाउनु हो।

2. पिपेट टिप्स, सेन्ट्रीफ्यूज ट्युबहरू, पिपेटहरू - RNase एक्लै स्टेरिलाइजेशनद्वारा निष्क्रिय गर्न सकिँदैन, त्यसैले पिपेट टिपहरू र सेन्ट्रीफ्यूज ट्यूबहरूलाई DEPC बाट व्यवहार गर्नुपर्छ, तिनीहरू DEPC उपचार गरिएको भनी चिन्ह लगाइए पनि।विशेष-उद्देश्य पिपेट प्रयोग गर्नु राम्रो हुन्छ, प्रयोग गर्नु अघि 75% अल्कोहल कपास बलले यसलाई पुछ्नुहोस्, विशेष गरी रड;थप रूपमा, हेड रिमूभर प्रयोग नगर्न निश्चित हुनुहोस्।

3. पानी/बफर RNase प्रदुषण मुक्त हुनुपर्छ।

4. कम्तिमा 75% अल्कोहल कपासको बलले परीक्षण तालिका सफा गर्नुपर्छ।

5.Endogenous RNase सबै तन्तुहरूमा अंतर्जात इन्जाइमहरू हुन्छन्, त्यसैले तरल नाइट्रोजनको साथ तन्तुहरूलाई छिटो चिसो पार्नु नै क्षय कम गर्ने उत्तम तरिका हो।तरल नाइट्रोजन भण्डारण / पीस विधि साँच्चै असुविधाजनक छ, तर अन्तर्जात इन्जाइमहरूको उच्च स्तर भएका तन्तुहरूको लागि यो एक मात्र तरिका हो।

6. RNA नमूनाहरू RNA निकासी उत्पादनहरूमा RNase प्रदूषणको ट्रेसहरू हुन सक्छन्।

7. प्लाज्मिड निकासी प्लाज्मिड निकासीले प्रायः RNA लाई घटाउन Rnase को प्रयोग गर्दछ, र अवशिष्ट Rnase लाई Proteinase K मार्फत पचाउनु पर्छ र PCI द्वारा निकाल्नु पर्छ।

8. RNA भण्डारण कम तापक्रममा भण्डारण गरिएको भए पनि, RNase को ट्रेस मात्राले RNA को ह्रास निम्त्याउँछ।RNA को दीर्घकालीन संरक्षणको लागि उत्तम समाधान नुन/अल्कोहल निलम्बन हो, किनभने रक्सीले कम तापक्रममा सबै इन्जाइम्याटिक गतिविधिलाई रोक्छ।

9. जब क्याशन (Ca, Mg) मा यी आयनहरू हुन्छन्, 80C मा 5 मिनेटको लागि तताउँदा RNA क्लिभ हुन सक्छ, त्यसैले RNA तताउन आवश्यक छ भने, संरक्षण समाधानमा एक चेलेटिंग एजेन्ट (1mM सोडियम साइट्रेट, pH 6.4) समावेश हुनुपर्छ।

10. पछिल्ला प्रयोगहरूमा प्रयोग गरिएका इन्जाइमहरू RNase द्वारा दूषित हुन सक्छन्।

RNA निकासीका लागि 10 सुझावहरू

1: तुरुन्तै RNase गतिविधि रोक्न।नमूनाहरू सङ्कलन पछि तुरुन्तै जम्मा हुन्छन्, र RNase lysis को समयमा द्रुत अपरेशन द्वारा निष्क्रिय हुन्छ।

२: उच्च राइबोजाइम सामग्री भएका तन्तुका लागि उपयुक्त निकासी विधि छनोट गर्नुहोस्, र एडिपोज टिस्युलाई फिनोल युक्त विधि प्रयोग गर्नु उत्तम हुन्छ।

3: भविष्यवाणी गुणस्तर उत्तरी आवश्यक छ, cDNA पुस्तकालय निर्माण उच्च अखण्डता आवश्यक छ, र RT-PCR र RPA (Ribonuclease संरक्षण परख) उच्च अखण्डता आवश्यक छैन।RT-PCR लाई उच्च शुद्धता (इन्जाइम इन्हिबिटर अवशेषहरू) चाहिन्छ।

4: पूर्ण एकरूपता उत्पादन सुधार गर्न र क्षरण कम गर्न कुञ्जी हो।

5: आरएनए इलेक्ट्रोफोरेसिस पत्ता लगाउनको पूर्णता जाँच गर्नुहोस्, 28S: 18S = 2: 1 पूर्ण चिन्ह हो, 1: 1 धेरै प्रयोगहरूको लागि पनि स्वीकार्य छ।

6: RT-PCR को लागि DNA हटाउने, array विश्लेषण DNA हटाउन Dnase I प्रयोग गर्नु राम्रो हुन्छ।

7: एक्सोजेनस इन्जाइमहरूको प्रदूषण कम गर्नुहोस् - इन्जाइमहरू बाहिरबाट आयात गर्न सकिँदैन।

8: कम-सांद्रता न्यूक्लिक एसिड केन्द्रित गर्दा, एक सह-वर्षा अभिकर्मक थपिनुपर्छ।तर इन्जाइमहरू र डीएनए प्रदूषण भएको सह-प्रेसिपिटेन्टलाई रोक्न।

9: आरएनएलाई राम्ररी विघटन गर्नुहोस्, आवश्यक भएमा, 5 मिनेटको लागि 65C मा तातो गर्नुहोस्।

उपयुक्त भण्डारण विधि

यसलाई छोटो समयको लागि -20C मा भण्डारण गर्न सकिन्छ, र -80C मा लामो समयको लागि।आरएनए उपजमा सुधार गर्ने पहिलो चरण भनेको विभिन्न नमूनाहरूको आरएनए सामग्री धेरै फरक हुन्छ भन्ने महसुस गर्नु हो।उच्च प्रचुरता (2-4ug/mg) जस्तै कलेजो, प्यान्क्रियाज, हृदय, मध्यम प्रचुरता (0.05-2ug/mg) जस्तै मस्तिष्क, भ्रूण, मृगौला, फोक्सो, थाइमस, अंडाशय, कम प्रचुरता (<0.05ug/mg) mg) जस्तै मूत्राशय, हड्डी, बोसो।

1: RN रिलिज गर्न कोशिकाहरू - यदि आरएनए जारी गरिएको छैन भने, उपज कम हुनेछ।इलेक्ट्रिक homogenization अन्य homogenization विधिहरु भन्दा राम्रो काम गर्दछ, तर अन्य विधिहरु जस्तै तरल नाइट्रोजन मासिंग, enzymatic पाचन (Lysozyme/Lyticase) संग संयोजन गर्न आवश्यक हुन सक्छ।

2: निकासी विधि को अनुकूलन।फिनोल-आधारित विधिहरूको साथमा सबैभन्दा ठूलो समस्याहरू अपूर्ण स्तरीकरण र आंशिक आरएनए हानि हुन् (सुपरनेटेन्ट पूर्ण रूपमा हटाउन सकिँदैन)।अपूर्ण स्तरीकरण उच्च न्यूक्लिक एसिड र प्रोटीन सामग्रीको कारण हो, जुन प्रयोग गरिएको लाइसेटको मात्रा बढाएर वा नमूनाको मात्रा घटाएर समाधान गर्न सकिन्छ।क्लोरोफर्म निकासीको एक चरण एडिपोज टिश्युमा थपियो।आरएनए नोक्सानलाई ब्याक-पम्पिङ गरेर वा सेन्ट्रीफ्युगेशन पछि जैविक तह हटाएर कम गर्न सकिन्छ।स्तम्भ सेन्ट्रीफ्यूगेसन-आधारित विधिहरूसँग सबैभन्दा ठूलो समस्या अतिरिक्त नमूना हो।

क्लासिक निकासी सुझावहरू

1. फिनोल शुद्धिकरण: 1:1 फिनोल/क्लोरोफर्मको बराबर मात्रा थप्नुहोस् र 1-2 मिनेटको लागि जोडदार रूपमा मिश्रण गर्नुहोस्।२ मिनेटको लागि उच्च गतिमा सेन्ट्रीफ्यूज गर्नुहोस्।सावधानीपूर्वक supernatant (80-90%) हटाउनुहोस्।बीचको तहमा कहिल्यै नपुग्नुहोस्।प्रतिक्रिया समाधान को एक बराबर मात्रा Phenol / क्लोरोफर्म मा थप्न सकिन्छ र supernatant हटाइयो।उपज सुधार गर्न न्यूक्लिक एसिड वर्षाको लागि दुई सुपरनेटेन्टहरू सँगै मिसाउन सकिन्छ।मिश्रण गर्दा धेरै कोमल नहुनुहोस्, र सबै सुपरनेटेन्ट हटाउन प्रयास नगर्नुहोस्।

2. 70-80% इथानोलले धुने: धुने समयमा, अवशिष्ट नुन पखालिएको सुनिश्चित गर्न न्यूक्लिक एसिडलाई निलम्बन गर्नुपर्छ।एकै समयमा, इथानोल खन्याउने तुरुन्तै, केही सेकेन्डको लागि उच्च गतिमा सेन्ट्रीफ्यूज गर्नुहोस्, र त्यसपछि पिपेटको साथ अवशिष्ट इथानोल हटाउनुहोस्।5-10 मिनेटको लागि कोठाको तापमानमा खडा भएपछि भंग गर्नुहोस्।

11. विशेष संस्थाहरूको निकासी

1. रेशायुक्त तन्तु: मुटु/कंकाल मांसपेशी जस्ता फाइबरयुक्त तन्तुबाट आरएनए निकासीको कुञ्जी तन्तुलाई पूर्ण रूपमा बाधा पुर्‍याउनु हो।यी तन्तुहरूमा कोशिकाको घनत्व कम हुन्छ, त्यसैले तन्तुको प्रति एकाइ तौलमा आरएनएको मात्रा कम हुन्छ, र सकेसम्म धेरै प्रारम्भिक मात्रा प्रयोग गर्नु राम्रो हुन्छ।चिसो अवस्थाहरूमा टिश्युलाई राम्ररी पीस गर्न निश्चित हुनुहोस्।

२. उच्च प्रोटिन/फ्याट सामग्री भएका तन्तुहरू: मस्तिष्क/तरकारीमा बोसोको मात्रा बढी हुन्छ।PCI निकासी पछि, supernatant मा सेतो floccules समावेश गर्दछ।क्लोरोफर्मको साथ सुपरनेटेन्ट पुन: निकाल्नुपर्छ।

3. उच्च न्यूक्लिक एसिड/राइबोजाइम सामग्री भएका तन्तुहरू: प्लीहा/थाइमसमा उच्च न्यूक्लिक एसिड र राइबोजाइम सामग्री हुन्छ।चिसो अवस्थाहरूमा टिस्युलाई पीस्नु र द्रुत एकरूपताले प्रभावकारी रूपमा राइबोजाइमहरू निष्क्रिय पार्न सक्छ।यद्यपि, यदि लाइसेट धेरै चिसो छ (उच्च न्यूक्लिक एसिड सामग्रीको कारण), PCI निकासी प्रभावकारी रूपमा स्तरीकरण गर्न सक्षम हुनेछैन;थप lysate थप्दा यो समस्या समाधान गर्न सक्छ।धेरै PCI निकासीले थप अवशिष्ट डीएनए हटाउन सक्छ।यदि अल्कोहल थपेपछि तुरुन्तै सेतो अवक्षेपण बन्यो भने, यसले डीएनए प्रदूषणलाई संकेत गर्दछ।विघटन पछि एसिडिक PCI संग पुन: निकासी DNA प्रदूषण हटाउन सक्छ।

4. बिरुवाको तन्तु: बिरुवाको तन्तु जनावरको तन्तु भन्दा जटिल हुन्छ।सामान्यतया, बिरुवाहरू तरल नाइट्रोजन अवस्थाहरूमा जमीनमा हुन्छन्, त्यसैले अन्तर्जात इन्जाइमहरू द्वारा आरएनए गिरावट असामान्य छ।यदि ह्रास समस्या समाधान भएन भने, यो लगभग निश्चित रूपमा नमूना मा समावेश अशुद्धता को कारण हो।धेरै बिरुवाहरूमा रहेको अशुद्धताले अवशेषहरू निम्त्याउँछ, र अवशेषहरूको कारण प्रायः यो हो किनभने यी अशुद्धताहरू आरएनएसँग केही समानताहरू छन्: तपाईं अवक्षेपण गर्नुहुन्छ र म अवक्षेपित हुन्छ, र तपाईंले सोख्नु हुन्छ र मैले सोख्छु।यी विशेषताहरूले निर्धारण गर्दछ कि तिनीहरू धेरै बलियो इन्जाइम अवरोधक हुन्।

हाल, व्यावसायिक आरएनए निकासी अभिकर्मकहरू सानो समायोजनको साथ लगभग सबै जनावरको तन्तुहरूमा अनुकूलित गर्न सकिन्छ, तर त्यहाँ थोरै व्यावसायिक आरएनए निकासी अभिकर्मकहरू छन् जुन धेरैजसो बिरुवाको तन्तुहरूको लागि उपयुक्त हुन सक्छ।सौभाग्य देखि, Foregene विशेष प्रदान गर्न सक्छप्लान्ट आरएनए निकासी किटहरू, हामी संग छप्लान्ट कुल आरएनए अलगाव किट, प्लान्ट टोटल आरएनए आइसोलेशन किट प्लस।पछिल्लो विशेष रूप देखि उच्च polysaccharide र polyphenol सामग्री संग बिरुवाहरु को लागी डिजाइन गरिएको छ।आरएनए निकासीको लागि, प्रयोगशाला प्रयोगकर्ताहरूबाट प्रतिक्रिया विशेष गरी राम्रो छ।

12. नमूना फ्रिजिङ र पग्लिने प्रभाव जमेको नमूना ठूलो हुन सक्छ, र RNA निकासीको लागि प्रयोग गर्नु अघि यसलाई काट्न आवश्यक छ।नमूनाहरू काट्ने क्रममा (सम्भवतः आंशिक रूपमा) पग्लिन्छन्।जमेको नमूनाहरू आरएनए निकासी अघि तौल्नु आवश्यक हुन सक्छ, र यो प्रक्रियाको क्रममा पग्लने निश्चित रूपमा हुनेछ।कहिलेकाहीँ, तरल नाइट्रोजन मिलिङ प्रक्रियाको समयमा नमूनाको पग्लन पनि हुन्छ;वा जमेको नमूनालाई लिक्विड नाइट्रोजन मिलिङ बिना सिधै लाइसेटमा थपिएको छ, र पूर्ण एकरूपता हुनु अघि पग्लने निश्चित रूपमा हुनेछ।प्रयोगहरूले देखाएको छ कि फ्रोजन टिस्युहरू ताजा टिश्युहरू भन्दा पग्लिने क्रममा आरएनए क्षरणको लागि बढी जोखिममा हुन्छन्।सम्भावित कारण: फ्रिज-थउ प्रक्रियाले कोशिका भित्रको संरचनाहरूलाई बाधा पुर्‍याउँछ, यसले अन्तर्जात इन्जाइमहरू आरएनएसँग प्रत्यक्ष सम्पर्कमा आउन सजिलो बनाउँछ।

13. RNA गुणस्तरको निर्णय सामान्यतया, इलेक्ट्रोफोरेसिस RNA को शुद्धता न्याय गर्न प्रयोग गरिन्छ, र A260/A280 RNA को शुद्धता न्याय गर्न प्रयोग गरिन्छ।सिद्धान्तमा, अक्षुण्ण RNA सँग 28S:18S = 2.7:1 को अनुपात छ, र धेरैजसो डेटाले 28S:18S = 2:1 को अनुपातलाई जोड दिन्छ।तथ्य यो हो कि कोषहरू बाहेक अन्य नमूनाहरूबाट निकालिएको लगभग कुनै पनि आरएनए २:१ अनुपातमा छैन (यो Agilent Bioanalyzer प्रयोग गरेर प्राप्त गरिएको थियो)।

RNA को इलेक्ट्रोफोरेसिस परिणामहरू माध्यमिक संरचना, इलेक्ट्रोफोरेसिस अवस्था, नमूना लोड, EB द्वारा संतृप्तिको डिग्री, आदि सहित धेरै कारकहरूद्वारा प्रभावित हुन्छन्। RNA पत्ता लगाउन र नियन्त्रणको रूपमा DNA मार्कर प्रयोग गर्न नेटिभ इलेक्ट्रोफोरेसिस प्रयोग गर्नुहोस्।यदि 2kb मा 28S र 0.9kb मा 18S स्पष्ट छ, र 28S: 18S > 1, पूर्णताले पछिल्ला प्रयोगहरूको आवश्यकताहरू पूरा गर्न सक्छ।

A260/A280 एक सूचक हो जसले धेरै भ्रम पैदा गरेको छ।सबैभन्दा पहिले, यो न्यूक्लिक एसिडको लागि यो सूचकको मूल अर्थ स्पष्ट गर्न आवश्यक छ: शुद्ध आरएनए, यसको A260/280 = लगभग 2.0।शुद्ध RNA 'कारण' हो र A260/A280 = 2 'प्रभाव' हो।अब सबैले A260/A280 लाई 'कारण' को रूपमा प्रयोग गरिरहेका छन्, यो सोचेर "यदि A260/A280 = 2 हो भने, RNA शुद्ध हो", जसले स्वाभाविक रूपमा भ्रम निम्त्याउँछ।

यदि तपाईंलाई रुचि छ भने, तपाईंले आफ्नो आरएनए नमूनामा फिनोल, गुआनिडाइन आइसोथियोसाइनेट, PEG, आदि जस्ता निकासीमा प्रयोग हुने थोरै अभिकर्मक थप्न सक्नुहुन्छ, र त्यसपछि A260/A280 अनुपात नाप्नुहोस्।वास्तविकता यो हो कि आरएनए निकासीका लागि प्रयोग गरिएका धेरै अभिकर्मकहरू, साथै नमूनामा धेरै अशुद्धताहरू, A260 र A280 वरिपरि अवशोषित हुन्छन्, जसले A260/A280 लाई असर गर्छ।

अहिलेको सबैभन्दा उपदेशात्मक दृष्टिकोण भनेको 200-300 nm दायरामा आरएनए नमूनाहरू स्क्यान गर्नु हो।शुद्ध RNA को कर्भमा निम्न विशेषताहरू छन्: वक्र चिल्लो छ, A230 र A260 दुई इन्फ्लेक्शन बिन्दुहरू छन्, A300 0 को नजिक छ, A260/A280 = लगभग 2.0, र A260/A230 = लगभग 2.0।यदि स्क्यान डाटा उपलब्ध छैन भने, A260/A230 अनुपात पनि निर्धारण गरिनुपर्छ, किनकि यो अनुपात इन्जाइम्याटिक प्रतिक्रियालाई असर गर्ने सबै अशुद्धताहरू बोक्न बढी संवेदनशील हुन्छ।यन्त्रको रैखिक दायरालाई ध्यानमा राख्नुहोस् (A260 को लागि 0.1-0.5)।

त्यहाँ दुई अन्य उपयोगी घटनाहरू छन्: A260/A280 पानी मा मापन गर्दा अनुपात लगभग 0.3 कम हुनेछ;जबकि 10 mM EDTA मा मापन गरिएको अनुपात 1 mM EDTA मा मापन गरिएको भन्दा लगभग 0.2 बढी छ।

सम्बन्धित उत्पादनहरु:

चीन प्लान्ट कुल आरएनए अलगाव किट निर्माता र आपूर्तिकर्ता |Foregene (foreivd.com)

आरएनए अलगाव श्रृंखला आपूर्तिकर्ता र कारखाना |चीन आरएनए अलगाव श्रृंखला निर्माताहरू (foreivd.com)

आरएनए अलगाव श्रृंखला - Foregene Co., Ltd (foreivd.com)