यो राम्रोसँग थाहा छ कि केन्द्रीय सिद्धान्तमा, RNA DNA र प्रोटीन अभिव्यक्ति बीचको ट्रान्सक्रिप्शनल मध्यस्थ हो।DNA को पत्ता लगाउनको तुलनामा, RNA को पत्ता लगाउने जीवहरूमा जीन अभिव्यक्ति अधिक वस्तुनिष्ठ रूपमा प्रतिबिम्बित गर्न सक्छ।RNA समावेश गर्ने प्रयोगहरूमा समावेश छ: qRT-PCR, RNA-Seq, र फ्यूजन जीन पत्ता लगाउने, आदि। RNA को विशेषताहरूमा आधारित (RNA को चिनी रिंग DNA को सुगर रिंग भन्दा एक अधिक मुक्त हाइड्रोक्सिल समूह छ), वातावरणमा RNases को एक ठूलो संख्या संग मिलेर, RNA अधिक अस्थिर र DNA भन्दा सजिलो छ।फोहोर भित्र, फोहोर बाहिर, यदि RNA को गुणस्तर राम्रो छैन भने, प्रयोगात्मक परिणामहरू असंतोषजनक हुनुपर्छ, विशेष गरी गलत डाटा वा खराब पुनरावृत्तिको रूपमा प्रकट।तसर्थ, RNA को प्रशोधनमा थप ध्यान दिनु पर्छ, र गुणस्तर नियन्त्रणको लिङ्क पनि पछिको प्रयोगात्मक डेटाको शुद्धता र शुद्धता सुनिश्चित गर्न अझ महत्त्वपूर्ण छ।

RNA को गुणस्तर नियन्त्रणको लागि, त्यहाँ सामान्यतया निम्न सामान्य तरिकाहरू प्रयोग गरिन्छ:

• स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री
• agarose जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस
• Agilent Bioanalyzer
• वास्तविक समय फ्लोरोसेन्ट मात्रात्मक पीसीआर
• क्यूबिट फ्लोरोसेन्ट डाई विधि

01 स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री

RNA सँग संयुग्मित डबल बन्ड छ र 260nm को तरंगदैर्ध्यमा अवशोषण शिखर छ।Lambert-Beer को नियम अनुसार, हामी 260nm मा अवशोषण शिखरबाट RNA एकाग्रता गणना गर्न सक्छौं।थप रूपमा, हामी 260nm, 280nm र 230nm अवशोषण शिखरहरूको अनुपात अनुसार RNA को शुद्धता पनि गणना गर्न सक्छौं।280nm र 230nm क्रमशः प्रोटीन र साना अणुहरूको अवशोषण शिखरहरू हुन्।योग्य RNA शुद्धताको A260/A280 र A260/A230 को अनुपात 2 भन्दा बढी हुनुपर्छ। यदि यो 2 भन्दा कम छ भने, यसको मतलब RNA नमूनामा प्रोटिन वा सानो अणु प्रदूषण छ र फेरि शुद्ध गर्न आवश्यक छ।प्रदूषण स्रोतहरूले डाउनस्ट्रीम प्रयोगहरूलाई असर गर्नेछ, जस्तै PCR प्रतिक्रियाहरूको एम्प्लीफिकेशन दक्षतालाई रोक्न, गलत मात्रात्मक परिणामहरूको परिणामस्वरूप।RNA को शुद्धताले पछिल्ला परिणामहरूमा ठूलो प्रभाव पार्छ, त्यसैले स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री सामान्यतया न्यूक्लिक एसिड प्रयोगहरूमा पहिलो चरणमा अपरिहार्य गुणस्तर नियन्त्रण लिङ्क हो।

चित्र १. विशिष्ट RNA/DNA अवशोषण स्पेक्ट्रम

02 Agarose जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस

शुद्धताको अतिरिक्त, आरएनएको अखण्डता पनि आरएनएको गुणस्तर निर्धारण गर्नको लागि एक महत्त्वपूर्ण सूचक हो।RNA को ह्रासले नमूनामा धेरै संख्यामा छोटो टुक्राहरू निम्त्याउनेछ, त्यसैले RNA टुक्राहरूको संख्या जुन प्रभावकारी रूपमा पत्ता लगाउन सकिन्छ र सन्दर्भ अनुक्रमद्वारा कभर गर्न सकिन्छ।आरएनए अखण्डता 1% agarose जेल मा कुल RNA को इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा जाँच गर्न सकिन्छ।यो विधिले जेल आफैं कन्फिगर गर्न सक्छ, वा अखण्डता परीक्षणको लागि पूर्वनिर्मित E-Gel™ प्रणाली प्रयोग गर्न सक्छ।कुल RNA को 80% भन्दा बढी ribosomal RNA हो, जसमध्ये अधिकांश 28S र 18S rRNA (स्तनपायी प्रणालीहरूमा) बाट बनेको हुन्छ।राम्रो गुणस्तरको RNA ले 28S र 18S उज्यालो बारहरू क्रमशः 5 Kb र 2 Kb मा दुई स्पष्ट उज्यालो बारहरू देखाउनेछ, र अनुपात 2:1 को नजिक हुनेछ।यदि यो फैलिएको अवस्थामा छ भने, यसको मतलब RNA नमूना घटेको हुन सक्छ, र RNA को गुणस्तर परीक्षण गर्न पछि वर्णन गरिएको विधि प्रयोग गर्न सिफारिस गरिन्छ।

चित्र २. एगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिसमा डिग्रेडेड (लेन २) र अक्षुण्ण आरएनए (लेन ३) को तुलना

03 Agilent Bioanalyzer

माथि वर्णन गरिएको agarose जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस विधिको अतिरिक्त, जसले हामीलाई RNA को अखण्डता सजिलै र छिटो पहिचान गर्न मद्दत गर्न सक्छ, हामी RNA को अखण्डता निर्धारण गर्न Agilent bioanalyzer को पनि प्रयोग गर्न सक्छौं।यसले आरएनए एकाग्रता र अखण्डताको मूल्याङ्कन गर्न माइक्रोफ्लुइडिक्स, केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस, र प्रतिदीप्तिको संयोजन प्रयोग गर्दछ।आरएनए नमूनाको प्रोफाइलको विश्लेषण गर्नको लागि निर्मित एल्गोरिथ्म प्रयोग गरेर, एजिलेन्ट बायोएनालाइजरले सन्दर्भ आरएनए अखण्डता मान, आरएनए अखण्डता नम्बर (यसपछि आरआईएन भनिन्छ) [१] गणना गर्न सक्छ।RIN को मूल्य जति ठूलो हुन्छ, RNA को अखण्डता उच्च हुन्छ (1 अत्यन्तै कम हुन्छ, 10 सबैभन्दा पूर्ण हुन्छ)।RNA समावेश भएका केही प्रयोगहरूले गुणस्तर मूल्याङ्कनका लागि RIN लाई प्यारामिटरको रूपमा प्रयोग गर्न सुझाव दिन्छ।उदाहरणको रूपमा उच्च-थ्रुपुट अनुक्रमण प्रयोगहरू (यसपछि NGS भनिन्छ) लिएर, Oncomine™ मानव प्रतिरक्षा रिपर्टोरको दिशानिर्देशहरू, जुन थर्मो फिशरको Oncomine प्यानल श्रृंखलामा B सेल र T सेल एन्टिजेन रिसेप्टरहरू पत्ता लगाउन प्रयोग गरिन्छ, सुझाव दिन्छ कि RIN मानहरू भएका नमूनाहरू 4, 3, F भन्दा बढी मापन गर्न सकिन्छ।विभिन्न प्यानलहरूको लागि विभिन्न सिफारिस गरिएका दायराहरू छन्, र प्रायः उच्च RIN ले थप प्रभावकारी डेटा ल्याउन सक्छ।

चित्र 3, Oncomine™ मानव प्रतिरक्षा रिपर्टोयर प्रयोगहरूमा, 4 भन्दा बढी RIN भएका नमूनाहरूले थप प्रभावकारी रिडहरू र T सेल क्लोनहरू पत्ता लगाउन सक्छन्।【2】

यद्यपि, RIN मानमा पनि केही सीमितताहरू छन्।यद्यपि RIN को NGS प्रयोगात्मक डेटाको गुणस्तरसँग उच्च सम्बन्ध छ, यो FFPE नमूनाहरूको लागि उपयुक्त छैन।FFPE नमूनाहरू लामो समयको लागि रासायनिक रूपमा उपचार गरिएको छ, र निकालिएको RNA सामान्यतया अपेक्षाकृत कम RIN मान हुन्छ।यद्यपि, यसको मतलब यो होइन कि प्रयोगको प्रभावकारी डेटा असंतोषजनक हुनुपर्छ।FFPE नमूनाहरूको गुणस्तर सही रूपमा मूल्याङ्कन गर्न, हामीले RIN बाहेक अन्य मापनहरू प्रयोग गर्न आवश्यक छ।RIN को अतिरिक्त, Agilent bioanalyzer ले RNA गुणस्तरको मूल्याङ्कन प्यारामिटरको रूपमा DV200 मान पनि गणना गर्न सक्छ।DV200 एक प्यारामिटर हो जसले RNA नमूनामा 200 bp भन्दा ठूलो टुक्राहरूको अनुपात गणना गर्दछ।DV200 RIN भन्दा FFPE नमूना गुणस्तरको राम्रो सूचक हो।FFPE द्वारा निकालिएको आरएनएको लागि, यसको प्रभावकारी रूपमा पत्ता लगाउन सकिने जीनहरूको संख्या र जीनको विविधतासँग धेरै उच्च सम्बन्ध छ [३]।यद्यपि DV200 ले FFPE को गुणस्तर पत्ता लगाउने कमजोरीहरू पूरा गर्न सक्छ, Agilent bioanalyzer ले अझै पनि RNA नमूनाहरूमा गुणस्तर समस्याहरूको विस्तृत रूपमा विश्लेषण गर्न सक्दैन, नमूनाहरूमा अवरोधकहरू छन् वा छैनन्।अवरोधकहरूले आफैंले डाउनस्ट्रीम प्रयोगहरूको प्रवर्धन दक्षतालाई असर गर्न सक्छ र उपयोगी डेटाको मात्रा घटाउन सक्छ।नमूनामा अवरोधक छ कि छैन भनेर जान्नको लागि, हामी अर्को वर्णन गरिएको वास्तविक-समय फ्लोरोसेन्ट मात्रात्मक PCR विधि अपनाउन सक्छौं।

04 वास्तविक समय फ्लोरोसेन्ट मात्रात्मक पीसीआर

वास्तविक-समय फ्लोरोसेन्ट परिमाणात्मक PCR विधिले नमूनामा अवरोधकहरू मात्र पत्ता लगाउन सक्दैन, तर FFPE नमूनामा आरएनएको गुणस्तर पनि सही रूपमा प्रतिबिम्बित गर्दछ।Agilent जैविक विश्लेषकहरूको तुलनामा, वास्तविक-समय फ्लोरोसेन्स मात्रात्मक उपकरणहरू तिनीहरूको व्यापक प्रयोगको कारणले प्रमुख जैविक प्रयोगशालाहरूमा बढी लोकप्रिय छन्।RNA नमूनाहरूको गुणस्तर परीक्षण गर्न, हामीले GUSB (Cat no. Hs00939627) जस्ता आन्तरिक सन्दर्भ जीनहरूका लागि प्राइमर प्रोबहरू मात्र खरिद वा तयारी गर्नुपर्छ।पूर्ण मात्रात्मक प्रयोगहरू सञ्चालन गर्न प्राइमरहरू, प्रोबहरू र मापदण्डहरू (ज्ञात एकाग्रताको कुल आरएनए) को यो सेट प्रयोग गरेर, प्रभावकारी आरएनए टुक्रा एकाग्रतालाई आरएनए गुणस्तरको मूल्याङ्कन मानकको रूपमा गणना गर्न सकिन्छ (छोटोको लागि कार्यात्मक आरएनए परिमाण (FRQ))।NGS परीक्षणमा, हामीले RNA नमूनाहरूको FRQ सँग प्रभावकारी डेटा भोल्युमसँग धेरै उच्च सम्बन्ध रहेको फेला पार्यौं।0.2ng/uL FRQ भन्दा ठूला सबै नमूनाहरूको लागि, कम्तिमा 70% पढाइले सन्दर्भ अनुक्रमलाई प्रभावकारी रूपमा कभर गर्न सक्छ (चित्र 4)।

चित्र 4, फ्लोरोसेन्स मात्रात्मक विधिद्वारा पत्ता लगाइएको FRQ मानसँग NGS प्रयोगमा प्राप्त प्रभावकारी डेटासँग धेरै उच्च सम्बन्ध (R2>0.9) छ।रातो रेखा भनेको 0.2 ng/uL (log10 = -0.7) बराबरको FRQ मान हो।【4】

FFPE नमूनाहरूमा लागू हुने अतिरिक्त, वास्तविक-समय मात्रात्मक PCR विधिले नमूनाहरूमा अवरोधकहरूलाई प्रभावकारी रूपमा निगरानी गर्न सक्छ।हामी इन्टरनल पोजिटिभ कन्ट्रोल (IPC) र यसको परखको साथ प्रतिक्रिया प्रणालीमा पत्ता लगाउन नमूना थप्न सक्छौं, र त्यसपछि Ct मान प्राप्त गर्न प्रतिदीप्ति परिमाणीकरण गर्न सक्छौं।यदि Ct मान नो-नमूना प्रतिक्रियामा Ct मान भन्दा पछाडि छ भने, यसले संकेत गर्दछ कि अवरोधक नमूनामा अवस्थित छ र प्रतिक्रियामा प्रवर्धन दक्षतालाई रोक्छ।

05 क्यूबिट फ्लोरोसेन्ट डाई विधि

Qubit Fluorometer न्यूक्लिक एसिड एकाग्रता र शुद्धता पत्ता लगाउनको लागि सबैभन्दा सामान्य रूपमा प्रयोग हुने सानो यन्त्र हो, जुन सञ्चालन गर्न सजिलो छ र लगभग हरेक आणविक जीवविज्ञान प्रयोगशालामा अवस्थित छ।यो पत्ता लगाउन र न्यूक्लिक एसिड-बाइंडिंग फ्लोरोसेन्ट डाई (Qubit पत्ता लगाउने अभिकर्मक) द्वारा न्यूक्लिक एसिडको एकाग्रता सही रूपमा गणना गर्दछ।Qubit मा उच्च संवेदनशीलता र विशिष्टता छ, र सही रूपमा RNA लाई pg/µL एकाग्रतामा परिमाण गर्न सक्छ।न्यूक्लिक एसिड एकाग्रतालाई सही रूपमा मापन गर्ने प्रख्यात क्षमताको अतिरिक्त, थर्मो फिशरको पछिल्लो नयाँ मोडेल, क्युबिट 4.0, पनि आरएनएको अखण्डता पत्ता लगाउन सक्छ।Qubit 4.0′s RNA पत्ता लगाउने प्रणाली (RNA IQ Assay) ले दुईवटा विशिष्ट फ्लोरोसेन्ट रंगहरू पत्ता लगाएर RNA को अखण्डता पत्ता लगाउँछ।यी दुई फ्लोरोसेन्ट रंगहरू क्रमशः ठूला टुक्राहरू र आरएनएका साना टुक्राहरूमा बाँध्न सक्छन्।यी दुई फ्लोरोसेन्ट रंगहरूले नमूनामा आरएनएका ठूला टुक्राहरूको अनुपातलाई सङ्केत गर्छ, र यसबाट आरएनए गुणस्तर प्रतिनिधित्व गर्ने IQ (Integrity and Quality) मान गणना गर्न सकिन्छ।IQ मान दुबै FFPE र गैर-FFPE नमूनाहरूमा लागू हुन्छ, र त्यसपछिको अनुक्रम गुणस्तरमा ठूलो प्रभाव पार्छ।NGS प्रयोगहरूलाई उदाहरणको रूपमा लिँदै, Ion torrent™ प्लेटफर्ममा प्रदर्शन गरिएका RNA-Seq परीक्षण प्रयोगहरूमा, 4 भन्दा बढी IQ मानहरू भएका अधिकांश नमूनाहरूमा कम्तिमा 50% प्रभावकारी पढाइहरू थिए (चित्र 5)।माथि उल्लिखित पत्ता लगाउने विधिहरूसँग तुलना गर्दा, Qubit IQ Assay सञ्चालन गर्न धेरै सुविधाजनक मात्र होइन र कम समय लिन्छ (पाँच मिनेट भित्र), तर मापन गरिएको प्यारामिटर IQ मान र डाउनस्ट्रीम प्रयोगहरूको डेटा गुणस्तर बीचको ठूलो सम्बन्ध पनि छ।

चित्र ५, Qubit RNA IQ मान र RNA-Seq को म्याप गरिएको रिडहरू बीचको ठूलो सम्बन्ध छ।【5】

माथिको परिचय मार्फत, म विश्वास गर्छु कि सबैलाई विभिन्न RNA गुणस्तर नियन्त्रण विधिहरूको पर्याप्त बुझाइ छ।अभ्यास मा, तपाईं चयन गर्न सक्नुहुन्छनमूना प्रकार र अवस्थित उपकरणहरू अनुसार अनुरूप विधि।आरएनएको गुणस्तर नियन्त्रण गरेर मात्र हामी कमजोर नमूना गुणस्तरको कारणले गर्दा पछिल्ला प्रयोगहरूको असफलताबाट बच्न सक्छौं, जसले गर्दा बहुमूल्य समय, ऊर्जा र लागत बचत हुन्छ।

सन्दर्भ उत्पादनहरू:

पशु कुल आरएनए अलगाव किट

सेल कुल आरएनए अलगाव किट

सन्दर्भहरू

【1】श्रोडर, A., Mueller, O., Stocker, S. et al.RIN: RNA मापनमा अखण्डता मान तोक्नका लागि एक RNA अखण्डता नम्बर।BMC Molecular Biol 7, 3 (2006)।https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】 अनकम ह्युमन इम्युन रिपर्टोयर प्रयोगकर्ता गाइड (Pub. No. MAN0017438 Rev. C.0)।

【3】Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Enhanced Quality Metrics for Assessing RNA Archival Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue Samples, Toxicological Is20, Pages20, Toxicological Sciences, Page 01 ३५७–३७३,https://doi.org/10.1093/toxsci/