RT-qPCR प्रयोगले RNA निकासी र गुणस्तर मूल्याङ्कन, रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन र qPCR तीन चरणहरू समावेश गर्दछ, प्रत्येक चरणमा धेरै सावधानीहरू छन्, हामी तल विस्तृत रूपमा परिचय गर्नेछौं।

Ⅰआरएनए गुणस्तर मूल्याङ्कन

RT-qPCR प्रयोगमा, RNA निकासी पूरा भएपछि, RNA को गुणस्तर मूल्याङ्कन गर्न आवश्यक छ, र फलो-अप प्रयोग योग्य भएपछि मात्र गर्न सकिन्छ।मूल्याङ्कन विधिहरूमा स्पेक्ट्रोफोटोमिटर, Agilent जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस, Agilent 2100 विश्लेषण समावेश छ, जसमध्ये सबैभन्दा बढी प्रयोग हुने स्पेक्ट्रोफोटोमिटर र agarose जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस विधि पत्ता लगाउन सकिन्छ।यो ध्यान दिनुपर्छ कि यी दुई विधिहरू आरएनए एकाग्रता, शुद्धता र अखण्डताको पहिचान र विश्लेषण पूरा गर्न एकसाथ प्रयोग गर्न आवश्यक छ, ताकि आरएनएको गुणस्तर सुनिश्चित गर्न सकियोस्।

सम्बन्धित आरएनए अलगाव किट: 

सेल कुल आरएनए अलगाव किट

उच्च शुद्ध र उच्च गुणस्तरको कुल आरएनए विभिन्न कल्चर गरिएको सेलहरूबाट ११ मिनेटमा प्राप्त गर्न सकिन्छ।

पशु कुल आरएनए अलगाव किट

छिटो र कुशलतापूर्वक विभिन्न जनावरको तन्तुबाट उच्च शुद्धता र उच्च गुणस्तरको कुल आरएनए निकाल्नुहोस्।

स्पेक्ट्रोफोटोमिटर:

स्पेक्ट्रोफोटोमिटर मुख्यतया RNA को एकाग्रता र शुद्धता निर्धारण गर्न प्रयोग गरिन्छ, तर यसले RNA र जीनोमिक अवशेषहरूको अखण्डता पत्ता लगाउन सक्दैन।ती मध्ये, A260/280 र A260/230 RNA शुद्धता पत्ता लगाउनका लागि महत्त्वपूर्ण मापदण्डहरू हुन्, र RNA शुद्धता तिनीहरूको मानहरूको उतार-चढाव अनुसार पत्ता लगाउन सकिन्छ:

1. 1.9< A260/280< 2.1, RNA शुद्धता राम्रो छ भनेर संकेत गर्दै;A260/280<1.9, RNA मा प्रोटीन अवशेष हुन सक्छ भनेर संकेत गर्दछ;A260/280>2.1, RNA को सम्भावित आंशिक ह्रासको संकेत गर्दछ, जसलाई agarose gel electrophoresis द्वारा थप पुष्टि गर्न सकिन्छ।

2. 2.0< A260/230< 2.2, RNA शुद्धता राम्रो छ भनेर संकेत गर्दै;A260/230< 2.0, RNA मा जैविक अभिकर्मकहरूको अवशेषहरू हुन सक्छ, जस्तै फिनोल, इथेनॉल वा चिनीहरू हुन सक्ने संकेत गर्दछ।

Agarose जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस:

Agarose जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस परखले RNA अखण्डता, जीनोम र प्रोटीन अवशेषहरूको विश्लेषण गर्न सक्छ, तर RNA को एकाग्रतालाई सही रूपमा मापन गर्न वा जैविक अभिकर्मकहरूको अवशेषहरू पत्ता लगाउन सक्दैन।उदाहरणका लागि युकेरियोटिक आरएनए टेम्प्लेटहरू लिनुहोस्:

1. आरएनए एगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिसको अधीनमा थियो।यदि जेल नक्सामा 28sRNA, 18sRNA र 5.8sRNA को केवल तीन एकल ब्यान्डहरू थिए भने, यसले निकालिएको आरएनए अक्षुण्ण छ भनी संकेत गर्छ।यदि त्यहाँ तानेको घटना हो भने, यसले आरएनएको आंशिक गिरावटलाई संकेत गर्दछ।

2. यदि ग्लु होल र 28sRNA ब्यान्डको बीचमा एकल उज्यालो ब्यान्ड छ भने, त्यहाँ जीनोमिक DNA अवशेष हुन सक्छ।

3. यदि ग्लुको प्वालमा ब्यान्डहरू देखा पर्छन् भने, यसले प्रोटिन र अन्य म्याक्रोमोलेक्युलर पदार्थहरूको अवशेष हुन सक्छ भनेर संकेत गर्छ।

Ⅱ. उल्टो ट्रान्सक्रिप्शन

आरएनए निकासी पूरा भएपछि, यसलाई पछिका प्रयोगहरूको लागि सीडीएनएमा उल्टाउन आवश्यक छ, त्यसैले उल्टो चरण आवश्यक छ।रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेज र प्राइमरको चयनबाट प्रस्तुत गरिनेछ:

उल्टो ट्रान्सक्रिप्टेस चयन:

सामान्य रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेसहरूमा AMV RTase र MMLV RTase समावेश छन्।AMV RTase को RNase H सँग बलियो गतिविधि, छोटो संश्लेषण लम्बाइ, कम संश्लेषण मात्रा र राम्रो थर्मल स्थिरता (42 ~ 55℃) छ।MMLV RTase को RNase H गतिविधि कमजोर छ, संश्लेषण लम्बाइ लामो छ, संश्लेषण मात्रा उच्च छ, र थर्मल स्थिरता कमजोर छ (37 ~ 42℃)।

किनकी RNase H इन्जाइमले RNA टेम्प्लेटलाई घटाउने काम गरेको छ, कमजोर RNase H गतिविधि भएको MMLV लाई रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शनको बेला प्राथमिकताका साथ चयन गरिनु पर्छ, र पछि जेनेटिक इन्जिनियरिङ पछि, MMLV को थर्मल स्थिरता एक गुणात्मक छलांगमा पुगेको छ।Foregene लिँदैForeasy Reverse Transcriptase (M-MLV उल्टो ट्रान्सक्रिप्सनको लागि) उदाहरणको रूपमा, यो आनुवंशिक पुनर्संयोजन प्रविधि प्रयोग गरेर ई. कोलाई इन्जिनियर गरिएको ब्याक्टेरियामा व्यक्त गरिएको नयाँ रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेज हो।यो एक पुन: संयोजक DNA पोलिमरेज हो जसले एकल-स्ट्र्यान्डेड RNA, DNA, वा RNA:DNA हाइब्रिडबाट पूरक DNA स्ट्र्यान्डलाई संश्लेषण गर्दछ।यसमा कुनै RNase H गतिविधि, बलियो स्थिरता, बलियो RNA आत्मीयता, र उच्च पत्ता लगाउने संवेदनशीलता छैन।

 

Foreasy Reverse Transcriptase (M-MLV उल्टो ट्रान्सक्रिप्सनको लागि)

प्राइमर को चयन:

सामान्यतया RT प्राइमरहरू तीन प्रकारका हुन्छन्: ओलिगो डीटी, अनियमित प्राइमरहरू, र जीन-विशिष्ट प्राइमरहरू।विभिन्न प्रयोगात्मक आवश्यकताहरू अनुसार प्रयोगको लागि उपयुक्त प्राइमरहरू चयन गर्नुहोस्।

1. यदि टेम्प्लेट युकेरियोटिक मूलको हो र लेट सीडीएनए नियमित पीसीआर प्रवर्धनको लागि प्रयोग गरिन्छ भने, ओलिगो (डीटी) सिफारिस गरिन्छ;यदि पछिको प्रयोग qPCR को लागि मात्र प्रयोग गरिन्छ भने, ओलिगो (dT) लाई रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शनको प्रभावकारिता सुधार गर्न अनियमित प्राइमरहरूसँग मिसाउन सिफारिस गरिन्छ।

2. यदि टेम्प्लेट prokaryotes बाट हो भने, रेन्डम प्राइमरहरू वा जीन विशिष्ट प्राइमरहरू रिभर्स ट्रान्सक्रिप्सनको लागि चयन गर्नुपर्छ।

Ⅲ।qPCR

फ्लोरोसेन्स क्वान्टिफिकेशन मुख्यतया मात्रात्मक विधिहरू, प्राइमर डिजाइन सिद्धान्तहरू, ROX चयन, प्रतिक्रिया प्रणाली कन्फिगरेसन र प्रतिक्रिया अवस्था सेटिङ, आदि को चयन बाट विस्तृत छ।

मात्रात्मक विधिहरूको चयन:

मात्रात्मक विधिहरू सापेक्ष मात्रात्मक विधिहरू र निरपेक्ष मात्रात्मक विधिहरूमा विभाजित छन्।जीन अभिव्यक्तिमा केही उपचार विधिहरूको प्रभाव पत्ता लगाउन, विभिन्न समयमा जीन अभिव्यक्तिको भिन्नता पत्ता लगाउन र विभिन्न तन्तुहरूमा जीन अभिव्यक्तिको भिन्नता तुलना गर्न सापेक्ष परिमाणीकरण प्रयोग गर्न सकिन्छ।निरपेक्ष मात्रा निर्धारणले भाइरसमा न्यूक्लिक एसिडको मात्रा पत्ता लगाउन सक्छ र यस्तै।प्रयोगहरू गर्दा, हामीले आफ्नै प्रयोगहरू अनुसार उपयुक्त मात्रात्मक विधिहरू छनौट गर्नुपर्छ।

प्राइमर डिजाइन सिद्धान्तहरू:

qPCR का लागि प्राइमरको डिजाइन प्रत्यक्ष रूपमा प्रवर्धन दक्षता र उत्पादन विशिष्टतासँग सम्बन्धित छ।त्यसकारण, राम्रो प्राइमरहरू सही रूपमा डिजाइन गर्नु सफल qPCR को पहिलो चरण हो।प्राइमरको डिजाइनमा, परम्परागत प्राइमर डिजाइनको सिद्धान्त पूरा गर्दा निम्न सिद्धान्तहरूमा ध्यान दिनुपर्छ:

1. लक्ष्य टुक्राको लम्बाइ 100 र 300 bp बीच नियन्त्रण गरिन्छ;

२. जीनोमिक डीएनएको प्रभावबाट बच्न क्रस-एक्सोन डिजाइन;

3. डिजाइन गरिएका प्राइमरहरूलाई एम्प्लीफिकेशन दक्षताको लागि परीक्षण गर्न आवश्यक छ, र प्रवर्द्धन दक्षता मानक (90-110%) मा पुग्दा मात्र तिनीहरू मात्रात्मक प्रयोगहरूको लागि प्रयोग गर्न सकिन्छ;

4. प्राइमर एकाग्रता सामान्यतया 0.1uM र 1.0uM बीच अनुकूलित हुन्छ।

को चयनROX:

मात्रात्मक प्रतिक्रियाको प्रक्रियामा, ROX ले अप्टिकल मार्ग भिन्नता, पाइपिङ त्रुटि वा वाष्पीकरण र संक्षेपणको कारण भोल्युम भिन्नतालाई समान रूपमा समायोजन गर्न सक्छ, परिणामहरूको पुनरावृत्तिमा सुधार गर्दछ।यद्यपि, यो ध्यान दिनुपर्छ कि ROX को चयन उपकरणसँग सम्बन्धित छ।यदि qPCR उपकरणमा स्वचालित रूपमा प्वालहरू बीचको भिन्नता सच्याउने कार्य छ भने, यसले ROX थप्न आवश्यक छैन;अन्यथा, यो ROX सुधार थप्न आवश्यक छ।अभिकर्मकहरू खरिद गर्ने साना साझेदारहरू सही ROX छनोट गर्न प्रयोग गरिएको उपकरण अनुसार हुनुपर्छ, पछि गल्तीहरूबाट बच्न।

प्रतिक्रिया प्रणाली को तयारी:

20ul र 50ul को प्रतिक्रिया मात्रा रुचाइन्छ।प्रणाली तयार गर्दा निम्न कुराहरूमा ध्यान दिनुपर्छ:

1. प्रतिक्रिया प्रणाली अल्ट्रा-क्लिन वर्कबेन्च, नयाँ ddH मा भेन्टिलेशन द्वारा तयार गर्न आवश्यक छ।₂O प्रत्येक प्रयोगको लागि प्रयोग गरिन्छ;

2. प्रत्येक प्रयोगले प्रणालीमा प्रदूषण छ कि छैन भनेर प्रमाणित गर्न NTC तयार गर्न आवश्यक छ, र प्राइमरहरूको प्रत्येक जोडीले प्रणाली तयार गर्दा NTC गर्न आवश्यक छ;

3. आरएनए टेम्प्लेटमा gDNA अवशेष छ कि छैन भनेर पत्ता लगाउन, पत्ता लगाउनको लागि प्रत्येक नमूनाको लागि NRT तयार गर्न सकिन्छ;

4. प्रणाली तयार गर्दा, एक नमूनाको लागि कम्तिमा 3 प्राविधिक दोहोर्याउन सिफारिस गरिन्छ;

5. टेम्प्लेट cDNA हुँदा, qPCR प्रयोगमा रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन प्रणालीको अवरोध प्रभाव कम गर्न 5-10 पटक पातलो गर्न सिफारिस गरिन्छ।ढाँचाको मात्रालाई ग्रेडियन्टद्वारा अन्वेषण गर्नु राम्रो हुन्छ, ताकि CT मान २०-३० बीचमा आउँछ;

6. प्रतिक्रियाहरूको आवश्यक संख्या निर्धारण गर्नुहोस्, प्रतिक्रियाहरूको संख्याको आधारमा 5-10% वृद्धि गर्नुहोस्, र भोल्युम कन्फिगरेसन नम्बर गणना गर्नुहोस्;

7, प्रणाली प्रिमिक्स सिद्धान्त प्रयोग गरेर तयार गरिएको छ, सेन्ट्रीफ्यूगेसन पछि मिश्रण र कुनै बुलबुले सुनिश्चित गर्नुहोस्;

8, जहाँसम्म सम्भव छ समर्थन उपभोग्य वस्तुहरू छनौट गर्न।

सम्बन्धित RT-qPCR किट