फ्लोरोसेन्स क्वान्टिटेटिभ PCR (जसलाई TaqMan PCR पनि भनिन्छ, त्यसपछि FQ-PCR भनेर चिनिन्छ) संयुक्त राज्य अमेरिकामा PE (Perkin Elmer) द्वारा १९९५ मा विकसित गरिएको नयाँ न्यूक्लिक एसिड मात्रात्मक प्रविधि हो। यो प्रविधि फ्लोरोसेन्ट लेबल गरिएको प्रोब थपेर परम्परागत PCR मा आधारित छ।लचिलो PCR को तुलनामा, FQ-PCR सँग यसको मात्रात्मक कार्य महसुस गर्न धेरै फाइदाहरू छन्।यस लेखले प्रविधिको विशेषताहरू, सिद्धान्तहरू, विधिहरू, र अनुप्रयोगहरू संक्षिप्त रूपमा वर्णन गर्न चाहन्छ।

1 सुविधाहरू

FQ-PCR मा साधारण PCR को उच्च संवेदनशीलता मात्र होइन, तर फ्लोरोसेन्ट प्रोबको प्रयोगको कारणले गर्दा यसले फोटोइलेक्ट्रिक कन्डक्शन प्रणाली मार्फत PCR एम्प्लीफिकेशनको समयमा फ्लोरोसेन्ट सिग्नलको परिवर्तनलाई मात्रात्मक नतिजाहरू प्राप्त गर्नको लागि प्रत्यक्ष रूपमा पत्ता लगाउन सक्छ, जसले पारंपरिक PCR को धेरै कमजोरीहरूलाई पार गर्दछ, त्यसैले यसमा उच्च स्पेक्ट्रोसेन्टको उच्च स्पेक्ट्रोसिटी र उच्च स्पेक्ट्रोसेन्ट टेक्नोलोजी पनि छ।

उदाहरण को लागी, सामान्य PCR उत्पादनहरु लाई एगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस र एथिडियम ब्रोमाइड दाग पराबैंगनी प्रकाश संग वा polyacrylamide जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस र चाँदीको दाग द्वारा अवलोकन गर्न आवश्यक छ।यसका लागि धेरै उपकरणहरू मात्र आवश्यक पर्दैन, तर समय र प्रयास पनि लाग्छ।इथिडियम ब्रोमाइड प्रयोग गरिएको दाग मानव शरीरको लागि हानिकारक छ, र यी जटिल प्रयोगात्मक प्रक्रियाहरूले प्रदूषण र गलत सकारात्मकको लागि अवसर प्रदान गर्दछ।यद्यपि, FQ-PCR ले नमूना लोड गर्ने क्रममा एक पटक मात्र ढक्कन खोल्न आवश्यक छ, र त्यसपछिको प्रक्रिया पूर्ण रूपमा बन्द-ट्यूब सञ्चालन हुन्छ, जसमा PCR पोस्ट-प्रोसेसिङ आवश्यक पर्दैन, पारंपरिक PCR सञ्चालनहरूमा धेरै कमीहरू बेवास्ता गर्दै।प्रयोगमा सामान्यतया PE कम्पनी द्वारा विकसित ABI7100 PCR थर्मल साइकल प्रयोग गरिन्छ।

उपकरणमा निम्न विशेषताहरू छन्: ① फराकिलो अनुप्रयोग: यसलाई DNA र RNA PCR उत्पादन परिमाण, जीन अभिव्यक्ति अनुसन्धान, रोगजनक पत्ता लगाउन, र PCR अवस्थाहरूको अनुकूलनको लागि प्रयोग गर्न सकिन्छ।② अद्वितीय मात्रात्मक सिद्धान्त: फ्लोरोसेन्ट रूपमा लेबल गरिएको प्रोबहरू प्रयोग गरेर, लेजर उत्तेजना पछि PCR चक्रमा फ्लोरोसेन्सको मात्रा जम्मा हुनेछ, ताकि क्वान्टिफिकेशनको उद्देश्य हासिल गर्न सकिन्छ।③ उच्च कार्य क्षमता: निर्मित 9600 PCR थर्मल साइक्लर, कम्प्युटरले 1 देखि 2 घन्टा नियन्त्रित गरी 96 वटा नमूनाहरूको प्रवर्धन र मात्रा स्वतः र सिंक्रोनस पूरा गर्न।④ जेल इलेक्ट्रोफोरेसिसको लागि कुनै आवश्यकता छैन: नमूनालाई पातलो र इलेक्ट्रोफोरेसिस गर्न आवश्यक पर्दैन, प्रतिक्रिया ट्यूबमा सीधा पत्ता लगाउन विशेष प्रोब प्रयोग गर्नुहोस्।⑤ पाइपलाइनमा कुनै प्रदूषण छैन: अद्वितीय पूर्ण रूपमा संलग्न प्रतिक्रिया ट्यूब र फोटोइलेक्ट्रिक कन्डक्शन प्रणाली अपनाइन्छ, त्यसैले प्रदूषणको बारेमा चिन्ता लिनु पर्दैन।⑥नतिजाहरू पुन: उत्पादन योग्य छन्: परिमाणात्मक गतिशील दायरा परिमाणको पाँच अर्डर सम्म हुन्छ।तसर्थ, यो प्रविधि सफलतापूर्वक विकसित भएकोले, यो धेरै वैज्ञानिक अनुसन्धानकर्ताहरु द्वारा मूल्यवान छ र धेरै क्षेत्रहरु मा लागू गरिएको छ।

2 सिद्धान्त र विधिहरू

FQ-PCR को कार्य सिद्धान्त PCR प्रतिक्रिया प्रणालीमा फ्लोरोसेन्ट रूपमा लेबल गरिएको प्रोब थप्न Taq इन्जाइमको 5′→3′ exonuclease गतिविधि प्रयोग गर्नु हो।प्रोबले विशेष रूपमा प्राइमर अनुक्रममा रहेको डीएनए टेम्प्लेटसँग हाइब्रिडाइज गर्न सक्छ।प्रोबको 5′छेउ फ्लोरोसेन्स उत्सर्जन जीन FAM (6-carboxyfluorescein, 518nm मा फ्लोरोसेन्स उत्सर्जन शिखर) को साथ लेबल गरिएको छ, र 3′छेउलाई The fluorescence quenching group TAMRA (6-carboxytramethylrhodnc, 518nm) ले लेबल गरिएको छ। PCR एम्प्लीफिकेशनको समयमा प्रोबलाई विस्तार हुनबाट रोक्नको लागि प्रोबको सुरुमा फास्फोरिलेटेड हुन्छ।जब प्रोब अक्षुण्ण रहन्छ, क्वेन्चर समूहले उत्सर्जन समूहको प्रतिदीप्ति उत्सर्जनलाई दबाउँछ।एक पटक उत्सर्जन समूहलाई शमन समूहबाट अलग गरिसकेपछि, अवरोध हटाइन्छ, र 518nm मा अप्टिकल घनत्व बढ्छ र फ्लोरोसेन्स पत्ता लगाउने प्रणालीद्वारा पत्ता लगाइन्छ। पुनर्स्थापना चरणमा, प्रोब टेम्प्लेट डीएनएसँग हाइब्रिडाइज हुन्छ, र एक्सटेन्सन चरणमा टाक इन्जाइम एक्सटेन्सन चरणको साथमा DNA मा।जब प्रोब काटिन्छ, शमन प्रभाव जारी हुन्छ र फ्लोरोसेन्ट संकेत जारी हुन्छ।प्रत्येक पटक टेम्प्लेट प्रतिलिपि गरिएको छ, फ्लोरोसेन्ट संकेतको रिलीजको साथमा, एक प्रोब काटिएको छ।रिलीज गरिएको फ्लोरोफोरहरूको संख्या र PCR उत्पादनहरूको संख्या बीच एक-देखि-एक सम्बन्ध रहेको हुनाले, यो प्रविधिलाई टेम्प्लेटको सही मात्रा निर्धारण गर्न प्रयोग गर्न सकिन्छ।प्रयोगात्मक उपकरणमा सामान्यतया PE कम्पनी द्वारा विकसित ABI7100 PCR थर्मल साइकल प्रयोग गरिन्छ, र अन्य थर्मल साइकलहरू पनि प्रयोग गर्न सकिन्छ।यदि ABI7700 प्रतिक्रिया प्रकार प्रतिक्रिया प्रणाली प्रयोगको लागि प्रयोग गरिन्छ, प्रतिक्रिया पूरा भएपछि, मात्रात्मक परिणामहरू सीधा कम्प्युटर विश्लेषण मार्फत दिन सकिन्छ।यदि तपाइँ अन्य थर्मल साइकलहरू प्रयोग गर्नुहुन्छ भने, तपाइँले RQ+, RQ-, △RQ गणना गर्न एकै समयमा प्रतिक्रिया ट्यूबमा फ्लोरोसेन्स संकेत मापन गर्न फ्लोरोसेन्स डिटेक्टर प्रयोग गर्न आवश्यक छ।RQ+ ले नमूना ट्यूबको फ्लोरोसेन्ट उत्सर्जन समूहको ल्युमिनेसेन्स तीव्रता र क्वेन्चिङ समूहको ल्युमिनेसेन्स तीव्रताको अनुपातलाई प्रतिनिधित्व गर्दछ, RQ- ले खाली ट्यूबमा दुईको अनुपातलाई प्रतिनिधित्व गर्दछ, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) ले PCR सङ्केतको मात्रालाई प्रतिनिधित्व गर्दछ। ।फ्लोरोसेन्ट प्रोबहरूको परिचयको कारण, प्रयोगको विशिष्टता उल्लेखनीय रूपमा सुधार भएको छ।प्रोब डिजाइनले सामान्यतया निम्न सर्तहरू पूरा गर्नुपर्छ: ①बाइन्डिङको विशिष्टता सुनिश्चित गर्न प्रोबको लम्बाइ लगभग २०-४० आधारहरू हुनुपर्छ।②एकल न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमहरूको नक्कलबाट बच्न GC आधारहरूको सामग्री 40% र 60% को बीचमा छ।③ हाइब्रिडाइजेशन वा प्राइमरसँग ओभरल्याप नगर्नुहोस्।④ प्रोब र टेम्प्लेट बीचको बाइन्डिङको स्थिरता प्राइमर र टेम्प्लेट बीचको बाइन्डिङको स्थिरता भन्दा ठूलो छ, त्यसैले प्रोबको Tm मान प्राइमरको Tm मान भन्दा कम्तीमा 5°C उच्च हुनुपर्छ।थप रूपमा, प्रोबको एकाग्रता, प्रोब र टेम्प्लेट अनुक्रम बीचको समानता, र प्रोब र प्राइमर बीचको दूरी सबैले प्रयोगात्मक परिणामहरूमा प्रभाव पार्छ।

सम्बन्धित उत्पादनहरु:

चीन Lnc-RT Heroᵀᴹ I (gDNase सँग) (lncRNA बाट पहिलो-स्ट्र्यान्ड cDNA संश्लेषणको लागि सुपर प्रिमिक्स) निर्माता र आपूर्तिकर्ता |Foregene (foreivd.com)

चीन वास्तविक समय पीसीआर Easyᵀᴹ-Takman निर्माता र आपूर्तिकर्ता |Foregene (foreivd.com)