RT-qPCR आणविक जीवविज्ञानको आधारभूत प्रयोग हो, र सबैले यससँग परिचित हुनुपर्छ।यसले मुख्यतया तीन चरणहरू समावेश गर्दछ: आरएनए निकासी, सीडीएनएमा उल्टो ट्रान्सक्रिप्सन, र वास्तविक समय फ्लोरोसेन्ट मात्रात्मक पीसीआर।यसले मद्दत गर्दैन, के भइरहेको छ?यसमा समस्या हुने सम्भावना छउल्टो ट्रान्सक्रिप्शन प्रयोग!यद्यपि यस्तो देखिन्छ कि रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन प्रयोगले मात्र RNA, dNTP, प्राइमरहरू, र थप्न आवश्यक छउल्टो ट्रान्सक्रिप्टेससेन्ट्रीफ्यूज ट्यूबमा र राम्रोसँग मिलाउनुहोस्, तर वास्तविक सञ्चालन प्रक्रियामा, त्यहाँ अझै धेरै विवरणहरू छन् जसमा ध्यान दिन आवश्यक छ।यसको बारेमा जानौं!

RNA को गुणस्तर कसरी न्याय गर्ने?
cDNA प्राप्त गर्न, RNA को गुणस्तर महत्त्वपूर्ण छ!आरएनए गुणस्तर मुख्यतया दुई पक्षबाट पत्ता लगाउन सकिन्छ:
(१) आरएनए अखण्डता:आरएनए अखण्डता agarose जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा प्रमाणित गर्न सकिन्छ. eukaryotes लाई उदाहरणको रूपमा लिएर, पूर्ण कुल RNA मा तीनवटा स्पष्ट ब्यान्डहरू छन्, ठूला देखि सानो सम्म आणविक तौलहरू 28S, 18S, र 5S छन्, र 28S 18S भन्दा दोब्बर उज्यालो छ;यदि तीनवटा ब्यान्डहरू देख्न सकिन्छ, तर ब्यान्ड प्रकार धमिलो छ वा डिफ्यूजनको अर्थ आरएनए आंशिक रूपमा घटेको छ।यस समयमा, कृपया रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन प्रतिक्रिया तुरुन्तै प्रदर्शन गर्नुहोस् र उपयुक्त रूपमा टेम्प्लेट इनपुट बढाउनुहोस्;यदि सानो आणविक तौल भएको ब्यान्ड वा कुनै ब्यान्ड देख्न सकिँदैन भने, आरएनए पूर्ण रूपमा बिग्रेको छ र पुन: निकाल्न आवश्यक छ।Agilent 2100 ले शिखर रेखाचित्र र RIN मानको साथ आरएनएको अखण्डतालाई संकेत गर्दछ।यदि न्यूक्लिक एसिड अक्षुण्ण छ भने, इलेक्ट्रोफेरोग्रामको आधार रेखा समतल छ;यदि न्यूक्लिक एसिड गम्भीर रूपमा घटेको छ भने, आधाररेखा असमान छ र थप क्षरण शिखरहरू देखा पर्छन्;RIN को मूल्यले 0-10 को दायरा भित्र RNA को अखण्डता प्रतिबिम्बित गर्दछ, मूल्य जति ठूलो हुन्छ, RNA को गुणस्तर राम्रो हुन्छ।ठीक छ, पूर्णता को उच्च डिग्री।
(२) आरएनएको शुद्धता:OD260/280 को अनुपात UV स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा पत्ता लगाउन सकिन्छ।यदि OD260/280 को अनुपात 1.9 र 2.1 को बीचमा छ भने, शुद्धता धेरै राम्रो छ।
अवशिष्ट जीनोमिक डीएनएले गलत मात्रात्मक परिणामहरू निम्त्याउन सक्छ
जब आरएनए निकालिन्छ, हामीले प्राप्त गरेको आरएनए जीनोमिक डीएनए (gDNA) मा मिसिएको हुन सक्छ जुन सफा गरिएको छैन।त्यसकारण, उल्टो ट्रान्सक्रिप्शन पछि सीडीएनए पनि मिसाइनेछgDNA।डाउनस्ट्रीम को समयमाqPCRप्रतिक्रिया,cDNAर gDNA लाई एकै साथ प्रवर्द्धन गर्न सकिन्छ, जसको परिणामस्वरूप अपेक्षाकृत सानो CT मान हुन्छ, त्यसैले परिणामहरू पक्षपाती हुन सक्छन्।
त्यसोभए यो अवस्थामा हामीले के गर्नुपर्छ?फोरेजीनसुझाव दिन्छ:
(1) उल्टो RNA मा जीनोम सफाई प्रदर्शन गर्नुहोस्, जुन RNA निकासीको समयमा स्तम्भ निकासी द्वारा हटाउन सकिन्छ;
(२) निकालिएको आरएनएलाई DNase मार्फत उपचार गर्नुहोस्I , तर EDTA को साथ समाप्त गर्नुहोस्;
उल्टो ट्रान्सक्रिप्शन अभिकर्मकहरूकोजीनोम क्लियरिङ मोड्युलको साथ;

उल्टो ट्रान्सक्रिप्शनको लागि प्राइमर कसरी छनौट गर्ने?
रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन प्राइमरहरूले रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन प्रतिक्रियाको नतिजालाई पनि असर गर्छ।तपाईंले प्रयोगको विशिष्ट परिस्थिति अनुसार रिभर्स ट्रान्सक्रिप्सनको लागि अनियमित प्राइमरहरू, ओलिगो डीटी वा जीन-विशिष्ट प्राइमरहरू छनौट गर्न सक्नुहुन्छ:
(1) विशिष्ट ट्रान्सक्रिप्टहरू: जीन-विशिष्ट प्राइमरहरू सिफारिस गरिन्छ;
(२) लामो टुक्रा ट्रान्सक्रिप्टहरू: ओलिगो डीटी/जीन-विशिष्ट प्राइमरहरू सिफारिस गरिन्छ;
(3) लामो-खण्ड ट्रान्सक्रिप्टहरूको आन्तरिक टुक्राहरू: जीन-विशिष्ट प्राइमर/यान्डम प्राइमर/रेन्डम प्राइमर + ओलिगो डीटी।यदि पछिको qPCR प्रयोग गरिन्छ भने, Oligo dT एक्लै प्रयोग गर्न सकिँदैन, किनकि Oligo dT एक्लै प्रयोग गर्दा 3′ अन्त पूर्वाग्रह हुन सक्छ, जसले गलत qPCR प्रयोग परिणामहरू निम्त्याउँछ;
(4) miRNA: स्टेम-लूप प्राइमर वा टेलिङ प्राइमरहरू प्रयोग गर्न सकिन्छ।

रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन उत्पादन सीडीएनए परिमाणीकरणको लागि कति पटक पातलो हुनुपर्छ?
रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन उत्पादनको cDNA प्राप्त गरेपछि, qPCR प्रयोगहरूको लागि cDNA कति पटक पातलो गर्नुपर्छ भन्ने धेरै महत्त्वपूर्ण छ।यदि cDNA एकाग्रता धेरै उच्च वा धेरै कम छ भने, प्रवर्धन दक्षता प्रभावित हुन सक्छ।के cDNA एकाग्रता मापन गर्न सकिन्छ, र यो कसरी गर्नुपर्छ?
(१) रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन उत्पादनको cDNA एकाग्रता मापन गर्न सकिँदैन, किनभने cDNA उत्पादनको अतिरिक्त, रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन उत्पादनमा पनि रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन अवशिष्ट बफर, रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेज, प्राइमरहरू, इत्यादि समावेश हुन्छन्, जसले एकाग्रता मापन परिणामहरूमा हस्तक्षेप गर्नेछ र OD260/280, OD260/280 र abDNA236 लाई प्रतिबिम्बित गर्दैन। क्षेत्र।यतिबेला कोही साथीले भन्नेछन्, शुद्धिपछि एकाग्रता नाप्छु।यहाँ, फोरजीनले यो सम्झाउन चाहन्छ कि cDNA शुद्ध गर्न सिफारिस गरिएको छैन, किनकि उल्टो द्वारा प्राप्त cDNA को लम्बाइ फरक छ, र छोटो cDNA शुद्धीकरणमा हराउनेछ।
(2) त्यसोभए के गर्ने?qPCR प्रयोग गर्नु अघि, पूर्व-प्रयोग मार्फत cDNA को कमजोर ढाल निर्धारण गर्न सकिन्छ।उदाहरणका लागि: qPCR प्रयोगहरूका लागि टेम्प्लेटको रूपमा cDNA स्टक समाधान, 10-गुणा कमजोरी, र 100-गुणा कमजोरी प्रयोग गर्नुहोस्, र 18-28 को दायरामा CT मानको साथ कमजोरी कारक चयन गर्नुहोस्।

miRNA लाई कसरी उल्टो ट्रान्सक्राइब गरिनु पर्छ?
miRNA लगभग 22 nt को आकारको एकल-स्ट्र्यान्ड सानो अणु RNA हो जसले प्रोटीनको लागि कोड गर्दैन।यसको छोटो लम्बाइको कारण, परम्परागत qPCR विधिले यसलाई प्रत्यक्ष रूपमा मापन गर्न गाह्रो छ, त्यसैले यो अक्सर miRNA विस्तार गर्न आवश्यक छ;miRNA को लागि सामान्यतया प्रयोग गरिने उल्टो ट्रान्सक्रिप्शन विधिहरूमा स्टेम-लूप विधि र टेलिङ विधि समावेश छ।
स्टेम-लूप विधि भनेको स्टेम-लूप प्राइमरहरू थपेर miRNA विस्तार गर्नु हो।यो पत्ता लगाउने विधिमा उच्च संवेदनशीलता र विशिष्टता छ, तर पत्ता लगाउने थ्रुपुट कम छ।एउटा रिभर्स ट्रान्सक्रिप्सनले एउटा miRNA र आन्तरिक सन्दर्भ मात्र पत्ता लगाउन सक्छ;पुच्छर जोड्ने विधि दुईवटा मिलेर बनेको हुन्छ यो पोलीए पोलिमरेज र रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेज दुई इन्जाइमहरूको संयुक्त कार्यद्वारा पूरा हुन्छ।PolyA पोलिमरेज यसको लम्बाइ बढाउन miRNA मा PolyA टेलहरू थप्न जिम्मेवार छ, र रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेजले रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन प्रतिक्रिया गर्दछ।यस विधिमा उच्च पत्ता लगाउने थ्रुपुट छ र एक उल्टो ट्रान्सक्रिप्शनमा धेरै miRNA र आन्तरिक सन्दर्भहरू पत्ता लगाउन सक्छ, तर स्टेम-लूप विधिमा संवेदनशीलता र विशिष्टता कम छ।