रियल टाइम पीसीआर, जसलाई मात्रात्मक पीसीआर वा क्यूपीसीआर पनि भनिन्छ, पीसीआर प्रवर्धन उत्पादनहरूको वास्तविक-समय निगरानी र विश्लेषणको लागि एक विधि हो।
मात्रात्मक PCR मा सरल सञ्चालन, छिटो र सुविधाजनक, उच्च संवेदनशीलता, राम्रो दोहोरिने क्षमता, र कम प्रदूषण दरको फाइदाहरू भएकाले, यो व्यापक रूपमा चिकित्सा परीक्षण, औषधि प्रभावकारिता मूल्याङ्कन, जीन अभिव्यक्ति अनुसन्धान, ट्रान्सजेनिक अनुसन्धान, जीन पत्ता लगाउने, रोगजनक पत्ता लगाउने, जनावर र बोट पत्ता लगाउन प्रयोग गरिन्छ।, खाना परीक्षण र अन्य क्षेत्रहरू।
तसर्थ, तपाईं जीवन विज्ञानमा आधारभूत अनुसन्धानमा संलग्न हुनुहुन्छ, वा औषधि कम्पनीहरू, पशुपालन कम्पनीहरू, खाद्य कम्पनीहरू, वा प्रवेश-निकास निरीक्षण र क्वारेन्टाइन ब्यूरोहरू, वातावरणीय अनुगमन विभागहरू, अस्पतालहरू र अन्य एकाइहरूका कर्मचारीहरू पनि, तपाईं कम वा कम सम्पर्कमा आउनुहुनेछ।

वास्तविक समय पीसीआर को सिद्धान्त

रियल टाइम PCR एक विधि हो जसमा फ्लोरोसेन्ट पदार्थहरू PCR प्रतिक्रिया प्रणालीमा थपिन्छन्, र PCR प्रतिक्रियाको प्रक्रियामा फ्लोरोसेन्स संकेत तीव्रतालाई वास्तविक समयमा परिमाणात्मक PCR उपकरणद्वारा अनुगमन गरिन्छ, र अन्तमा प्रयोगात्मक डेटाको विश्लेषण र प्रशोधन गरिन्छ।

【प्रवर्धन वक्र】PCR को गतिशील प्रक्रिया वर्णन गर्ने वक्र हो।PCR को एम्प्लीफिकेशन कर्भ वास्तवमा मानक घातीय वक्र होइन, तर सिग्मोइड कर्भ हो।

[प्रवर्धन वक्रको प्लेटफर्म चरण]PCR चक्रको संख्या बढ्दै जाँदा, DNA पोलिमरेजको निष्क्रियता, dNTPs र प्राइमरहरूको ह्रास, र प्रतिक्रिया उप-उत्पादन पाइरोफोस्फेट, इत्यादिद्वारा संश्लेषण प्रतिक्रियाको अवरोध, PCR सधैं तीव्र रूपमा विस्तार हुँदैन।, र अन्ततः पठारमा प्रवेश गर्नेछ।

[प्रवर्द्धन वक्रको घातीय वृद्धि क्षेत्र]यद्यपि पठार चरण धेरै भिन्न हुन्छ, एम्प्लीफिकेशन कर्भको घातीय वृद्धि क्षेत्रको निश्चित क्षेत्रमा, पुनरावृत्ति धेरै राम्रो छ, जुन PCR को मात्रात्मक विश्लेषणको लागि धेरै महत्त्वपूर्ण छ।

[थ्रेसहोल्ड मान र Ct मान]हामीले एम्प्लीफिकेशन कर्भको घातीय वृद्धि क्षेत्रमा उपयुक्त स्थानमा फ्लोरोसेन्स पत्ता लगाउने सीमा मान सेट गर्छौं, अर्थात् थ्रेसहोल्ड मान (थ्रेसहोल्ड)।थ्रेसहोल्ड मान र एम्प्लीफिकेशन कर्भको प्रतिच्छेदन Ct मान हो, त्यो हो, Ct मानले थ्रेसहोल्ड मान पुग्दा चक्रहरूको संख्या (थ्रेसहोल्ड साइकल) लाई जनाउँछ।

तलको ग्राफले थ्रेसहोल्ड लाइन र एम्प्लीफिकेशन कर्भ, थ्रेसहोल्ड र Ct मान बीचको सम्बन्धलाई स्पष्ट रूपमा देखाउँछ।

【कसरी परिमाण गर्ने?】

यो गणितीय सिद्धान्तले प्रमाणित गरेको छ कि Ct मानको प्रारम्भिक टेम्प्लेटहरूको सङ्ख्याको लोगारिदमसँग उल्टो रैखिक सम्बन्ध छ।रियल टाइम पीसीआरले वास्तविक समयमा पीसीआर एम्प्लीफिकेशन उत्पादनहरू निगरानी गर्दछ र घातीय प्रवर्धन चरणमा तिनीहरूलाई परिमाण गर्दछ।

PCR को प्रत्येक चक्रको लागि, DNA द्रुत रूपमा 2 गुणाले बढ्यो, र चाँडै पठारमा पुग्यो।

सुरु हुने DNA को मात्रा A हो भनी मान्दै₀ , n चक्र पछि, DNA उत्पादनको सैद्धान्तिक मात्रालाई यसरी व्यक्त गर्न सकिन्छ:

A _n =A ₀ ×२ⁿ

त्यसपछि, प्रारम्भिक DNA मात्रा A 0 जति बढी हुन्छ, एम्प्लीफाइड उत्पादनको मात्रा चाँडै पत्ता लगाउने मान An मा पुग्छ, र An मा पुग्दा चक्रहरूको संख्या Ct मान हुन्छ।अर्थात्, प्रारम्भिक DNA मात्रा A 0 जति बढी हुन्छ, एम्प्लीफिकेशन कर्भको चुचुरो जति पहिले हुन्छ, र सोही अनुसार आवश्यक संख्याको चक्र n सानो हुन्छ।

हामी ज्ञात एकाग्रताको मानकको ढाँचा कमजोर गर्छौं र यसलाई रियल टाइम पीसीआरको लागि टेम्प्लेटको रूपमा प्रयोग गर्छौं, र DNA रकम बढीदेखि कम सुरु गर्ने क्रममा समान अन्तरालहरूमा एम्प्लीफिकेशन कर्भहरूको श्रृंखला प्राप्त गरिनेछ।Ct मान र प्रारम्भिक टेम्प्लेटहरूको सङ्ख्याको लगरिथम बीचको रेखीय सम्बन्ध अनुसार, a[मानक वक्र] सिर्जना गर्न सकिन्छ।

अज्ञात एकाग्रताको साथ नमूनाको Ct मानलाई मानक वक्रमा प्रतिस्थापन गरेर, अज्ञात एकाग्रताको नमूनाको प्रारम्भिक टेम्प्लेट रकम प्राप्त गर्न सकिन्छ, जुन वास्तविक समय PCR को मात्रात्मक सिद्धान्त हो।

वास्तविक समय PCR को पत्ता लगाउने विधि

वास्तविक समय पीसीआरले प्रतिक्रिया प्रणालीमा फ्लोरोसेन्स तीव्रता पत्ता लगाएर पीसीआर प्रवर्धन उत्पादनहरू पत्ता लगाउँदछ।

फ्लोरोसेन्ट डाई इम्बेडिङ विधिको सिद्धान्त】

फ्लोरोसेन्ट रङहरू, जस्तै TB Green ® , PCR प्रणालीहरूमा डबल-स्ट्र्यान्डेड DNA र बाध्यतामा फ्लोरोससँग गैर-विशेष रूपमा बाँध्न सक्छ।

प्रतिक्रिया प्रणालीमा प्रतिदीप्ति तीव्रता PCR चक्र को वृद्धि संग तीव्रता बढ्यो।प्रतिदीप्ति तीव्रता पत्ता लगाएर, प्रतिक्रिया प्रणालीमा डीएनए प्रवर्धनको मात्रा वास्तविक समयमा निगरानी गर्न सकिन्छ, र त्यसपछि नमूनामा सुरु टेम्प्लेटको मात्रा उल्टो अनुमान गर्न सकिन्छ।

【फ्लोरोसेन्ट प्रोब विधि को सिद्धान्त】

फ्लोरोसेन्ट जाँच5′ छेउमा फ्लोरोसेन्ट समूह र 3′ छेउमा क्वेन्चिङ समूह भएको न्यूक्लिक एसिड अनुक्रम हो, जसले टेम्प्लेटमा विशेष रूपमा बाँध्न सक्छ।जब प्रोब अक्षुण्ण हुन्छ, फ्लोरोफोर द्वारा उत्सर्जित प्रतिदीप्ति शमन समूह द्वारा निभाइन्छ र प्रतिदीप्ति हुन सक्दैन।जब प्रोब विघटित हुन्छ, फ्लोरोसेन्ट पदार्थ अलग हुनेछ र प्रतिदीप्ति उत्सर्जन हुनेछ।

PCR प्रतिक्रिया समाधानमा फ्लोरोसेन्ट प्रोब थपिएको छ।एनेलिङ प्रक्रियाको बखत, फ्लोरोसेन्ट प्रोब टेम्प्लेटको विशिष्ट स्थितिमा बाँध्नेछ।विस्तार प्रक्रियाको क्रममा, PCR इन्जाइमको 5′→3′ exonuclease गतिविधिले टेम्प्लेटसँग हाइब्रिडाइज गरिएको फ्लोरोसेन्ट प्रोबलाई विघटन गर्न सक्छ, र फ्लोरोसेन्ट पदार्थलाई फ्लोरोसेन्स उत्सर्जन गर्न अलग गरिएको छ।प्रतिक्रिया प्रणालीमा प्रोबको फ्लोरोसेन्स तीव्रता पत्ता लगाएर, PCR उत्पादनको प्रवर्धन मात्रा अनुगमन गर्ने उद्देश्य हासिल गर्न सकिन्छ।

【प्रतिदीप्ति पत्ता लगाउने विधि को चयन】

यदि यो उच्च समानताको साथ अनुक्रमहरू छुट्याउन र SNP टाइपिङ विश्लेषण जस्ता मल्टिप्लेक्स PCR पत्ता लगाउन प्रयोग गरिन्छ भने, फ्लोरोसेन्ट प्रोब विधि अपरिवर्तनीय छ।
अन्य वास्तविक समय पीसीआर प्रयोगहरूको लागि, एक सरल, सजिलो र कम लागत फ्लोरोसेन्ट काइमेरा विधि प्रयोग गर्न सकिन्छ।

अनुसन्धान बलियो विशिष्टता, मल्टिप्लेक्स पीसीआर सक्षम

कमजोरी

प्रवर्धनको लागि उच्च विशिष्टता आवश्यकताहरू;

मल्टिप्लेक्स पीसीआर गर्न सकिँदैन विशिष्ट प्रोब डिजाइन गर्न आवश्यक, उच्च लागत;

कहिलेकाहीँ प्रोब डिजाइन गाह्रो छ

सम्बन्धित उत्पादनहरु: