qPCR प्रयोगहरूमा, प्राइमर डिजाइन पनि एक धेरै महत्त्वपूर्ण लिङ्क हो।प्राइमरहरू उपयुक्त छन् वा छैनन् भन्ने कुरा प्रवर्द्धन दक्षता मानकमा पुग्छ कि हुँदैन, प्रवर्धित उत्पादनहरू विशिष्ट छन् कि छैनन्, र प्रयोगात्मक परिणामहरू उपलब्ध छन् कि छैनन् भन्ने कुरासँग नजिकको सम्बन्ध छ।
त्यसोभए कसरी qPCR प्राइमर विशिष्टता अझ राम्रो बनाउने?उच्च प्रवर्धन दक्षता?
आज, हामी तपाईंलाई qPCR प्राइमरहरू सँगै डिजाइन गर्न लैजानेछौं, र qPCR प्राइमर डिजाइनलाई प्रयोगहरूमा कुशल ज्ञान कौशल बन्न दिनुहोस्।
qPCR प्राइमरहरू डिजाइन गर्दा, सामान्यतया निम्न बिन्दुहरूमा ध्यान दिनुहोस्: प्राइमरहरू सकेसम्म धेरै भित्रीहरूमा डिजाइन गरिनु पर्छ, उत्पादनको लम्बाइ 100-300 bp हुनुपर्छ, Tm मान 60 डिग्री सेल्सियसको नजिक हुनुपर्छ, र अपस्ट्रीम र डाउनस्ट्रीम प्राइमरहरू सकेसम्म नजिक हुनुपर्छ, र प्राइमरको अन्त्य G वा C, आदि पर्खनुपर्छ।
1. इन्ट्रोनहरू फैलिएको प्राइमरहरूको डिजाइन
qPCR प्राइमरहरू डिजाइन गर्दा, भित्री भागहरूमा डिजाइन गरिएका प्राइमरहरू छनोट गर्नाले gDNA टेम्प्लेटलाई एम्प्लीफाइड हुनबाट रोक्न सक्छ, र उत्पादनहरू सबै cDNA को प्रवर्द्धनबाट व्युत्पन्न हुन्छन्, जसले गर्दा gDNA प्रदूषणको प्रभावलाई हटाउँछ।
2. प्राइमर लम्बाइ
प्राइमरको लम्बाइ सामान्यतया 18-30 nt को बीचमा हुन्छ, र एम्प्लीफिकेशन उत्पादनको लम्बाइ सकेसम्म 100-300 bp को बीचमा नियन्त्रण गर्नुपर्छ।
यदि प्राइमर धेरै छोटो छ भने, यसले गैर-विशिष्ट प्रवर्धनको नेतृत्व गर्नेछ, र यदि यो धेरै लामो छ भने, यसले सजिलैसँग माध्यमिक संरचना (जस्तै हेयरपिन संरचना) बनाउँछ।यदि प्रवर्धन उत्पादन धेरै लामो छ भने, यो पोलिमरेजको प्रतिक्रियाको लागि उपयुक्त छैन, जसले PCR प्रवर्धनको दक्षतालाई असर गर्नेछ।
3. GC सामग्री र Tm मान
प्राइमरहरूको GC सामग्री 40% र 60% बीचमा नियन्त्रण गर्नुपर्छ।यदि यो धेरै उच्च वा धेरै कम छ भने, यो प्रतिक्रिया सुरु गर्न अनुकूल छैन।उही Tm मान र annealing तापमान प्राप्त गर्न अगाडि र उल्टो प्राइमरहरूको GC सामग्री समान नजिक हुनुपर्छ।
Tm मान सम्भव भएसम्म 55-65°C को बीचमा हुनुपर्छ, सामान्यतया 60°C को वरिपरि, र माथिल्लो र डाउनस्ट्रीमको Tm मान सकेसम्म नजिक हुनुपर्छ, प्राथमिकता 4°C भन्दा बढी हुनु हुँदैन।
4. प्राइमरको 3′ अन्त्यमा A चयन नगर्नुहोस्
जब प्राइमरको 3′ अन्त बेमेल हुन्छ, त्यहाँ विभिन्न आधारहरूको संश्लेषण दक्षतामा ठूलो भिन्नताहरू छन्।जब अन्तिम आधार A हो, यसले बेमेलको अवस्थामा पनि चेन संश्लेषण सुरु गर्न सक्छ, र जब अन्तिम आधार T when हुन्छ, बेमेल प्रेरणको दक्षता धेरै कम हुन्छ।त्यसकारण, प्राइमरको 3′ छेउमा A छनोट नगर्ने प्रयास गर्नुहोस्, र T छनौट गर्नु राम्रो हुन्छ।
यदि यो एक प्रोब प्राइमर हो भने, प्रोबको 5′ छेउ G हुन सक्दैन, किनभने FAM फ्लोरोसेन्ट रिपोर्टर समूहमा एकल G आधार जडान हुँदा पनि, G ले FAM समूहद्वारा उत्सर्जित फ्लोरोसेन्ट सङ्केतलाई पनि निभाउन सक्छ, जसको परिणाम गलत नकारात्मक परिणामहरू निम्त्याउँछ।देखिन्छ।
5. आधार वितरण
प्राइमरमा चार आधारहरूको वितरण प्राथमिकतामा अनियमित हुन्छ, 3′ अन्तमा 3 भन्दा बढी लगातार G वा C, र 3 भन्दा बढी लगातार बेवास्ता गर्दै।G वा C GC-रिच अनुक्रम क्षेत्रमा जोडी बनाउन सजिलो छ।
6. प्राइमर डिजाइन क्षेत्र जटिल माध्यमिक संरचनाहरूबाट बच्नुपर्छ।
एम्प्लीफिकेशन उत्पादनको एकल स्ट्र्यान्डद्वारा बनेको माध्यमिक संरचनाले PCR को सहज प्रगतिलाई असर गर्नेछ।पहिले नै लक्ष्य अनुक्रममा माध्यमिक संरचना छ कि छैन भनेर भविष्यवाणी गरेर, प्राइमरहरूको डिजाइनमा यस क्षेत्रलाई बेवास्ता गर्ने प्रयास गर्नुहोस्।
7. प्राइमरहरू आफैं र प्राइमरहरू बीचको लगातार पूरक आधारहरूबाट बच्न प्रयास गर्नुपर्छ।
प्राइमर आफै र प्राइमर बीच लगातार 4 आधार पूरक हुन सक्दैन।प्राइमरमा आफैंमा पूरक अनुक्रम हुनु हुँदैन, अन्यथा यसले कपालको संरचना बनाउनको लागि आफैलाई तह गर्नेछ, जसले प्राइमर र टेम्प्लेटको एनेलिङ संयोजनलाई असर गर्नेछ।
अपस्ट्रिम र डाउनस्ट्रीम प्राइमरहरू बीच पूरक अनुक्रमहरू अवस्थित हुन सक्दैन।प्राइमरहरू बीचको पूरकताले प्राइमर डाइमरहरू उत्पादन गर्नेछ, जसले PCR दक्षता घटाउनेछ र मात्रात्मक शुद्धतालाई पनि असर गर्छ।यदि प्राइमर-डाइमर र हेयरपिन संरचनाहरू अपरिहार्य छन् भने, △G मान धेरै उच्च हुनु हुँदैन (4.5 kcal/mol भन्दा कम हुनुपर्छ)।
8. प्राइमरहरूले लक्षित विशिष्ट उत्पादनलाई बढाउँछ।
qPCR पत्ता लगाउने अन्तिम लक्ष्य लक्ष्य जीनको प्रचुरता बुझ्नु हो।यदि गैर-विशिष्ट प्रवर्धन हुन्छ भने, परिमाणीकरण गलत हुनेछ।त्यसकारण, प्राइमरहरू डिजाइन गरिसकेपछि, तिनीहरूलाई BLAST द्वारा परीक्षण गर्न आवश्यक छ, र उत्पादनहरूको विशिष्टता अनुक्रम डेटाबेसमा तुलना गरिन्छ।
अर्को, हामी मानव GAS6 (वृद्धि गिरफ्तारी विशिष्ट 6) जीनलाई qPCR प्राइमरहरू डिजाइन गर्न उदाहरणको रूपमा लिन्छौं।
01 क्वेरी जीन
होमो GAS6NCBI मार्फत।यहाँ, हामीले जीन नाम र प्रजातिहरू एकरूप छन् भनी सुनिश्चित गर्नको लागि तुलना गर्न ध्यान दिनुपर्छ।
02 जीन अनुक्रम पत्ता लगाउनुहोस्
(१) यदि लक्ष्य अनुक्रम जीनोमिक डीएनए हो भने, पहिलो चयन गर्नुहोस्, जुन जीनको जीनोमिक डीएनए अनुक्रम हो।
(२) यदि लक्ष्य अनुक्रम mRNA हो भने, दोस्रो चयन गर्नुहोस्।प्रविष्ट गरेपछि, तलको तालिकामा "CDS" मा क्लिक गर्नुहोस्।खैरो पृष्ठभूमि अनुक्रम जीनको कोडिङ अनुक्रम हो।
03 डिजाइन प्राइमर
प्राइमर-ब्लास्ट इन्टरफेस प्रविष्ट गर्नुहोस्
माथिल्लो बायाँमा फास्टा ढाँचामा जीन अनुक्रम नम्बर वा अनुक्रम प्रविष्ट गर्नुहोस्, र सान्दर्भिक प्यारामिटरहरू भर्नुहोस्।

"प्राइमरहरू प्राप्त गर्नुहोस्" मा क्लिक गर्नुहोस् र NCBI ले तपाईंलाई बताउन पप अप गर्नेछ कि यस्तो प्यारामिटर चयन अन्य स्प्लिसिङ भेरियन्टहरूमा विस्तार गरिनेछ।हामी विभिन्न स्प्लिसिङ भेरियन्टहरू जाँच्न सक्छौं र उपयुक्त प्राइमर जोडा प्राप्त गर्न तिनीहरूलाई पेश गर्न सक्छौं (तलको चित्रमा देखाइएको छ)।यो प्रक्रिया चल्न दशौं सेकेन्ड लाग्न सक्छ।
यी प्राइमर जोडीहरूको एनिलिङ तापक्रम लगभग ६० डिग्री सेल्सियस हुन्छ।प्रयोगको उद्देश्य अनुसार, प्रयोगको लागि मध्यम लम्बाइ, राम्रो विशिष्टता र कम आत्म-पूरक प्राइमरहरू छनौट गर्नुहोस्, र सफलता दर धेरै उच्च छ!
04प्राइमर विशिष्टता प्रमाणिकरण
वास्तवमा, प्राइमरहरू डिजाइन गर्नुको अतिरिक्त, प्राइमर-ब्लास्टले हामीले आफैंले डिजाइन गरेका प्राइमरहरू पनि मूल्याङ्कन गर्न सक्छ।प्राइमर डिजाइन पृष्ठमा फर्कनुहोस्, हामीले डिजाइन गरेका अपस्ट्रिम र डाउनस्ट्रीम प्राइमरहरू प्रविष्ट गर्नुहोस्, र अन्य प्यारामिटरहरू समायोजन गरिने छैन।पेश गरेपछि, तपाईंले प्राइमरहरूको जोडी अन्य जीनहरूमा पनि अवस्थित छ कि छैन भनेर हेर्न सक्नुहुन्छ।यदि ती सबैलाई हामीले विस्तार गर्न चाहेको जीनमा देखाइएको छ भने, यो प्राइमरको यो जोडीको विशिष्टता ठूलो छ भनेर संकेत गर्दछ!(उदाहरणका लागि, यो प्राइमर क्वेरीको मात्र परिणाम हो!)

05 प्राइमर गुणस्तर निर्णय
कस्तो प्रकारको प्राइमर "उत्तम" प्राइमर हो जसले "मानकसम्म एम्प्लीफिकेशन दक्षता", "प्रवर्धित उत्पादन विशेषताहरू", र "विश्वसनीय प्रयोगात्मक परिणामहरू" लाई संयोजन गर्दछ?
प्रवर्धन दक्षता

पग्लने वक्र
प्राइमरहरूको एम्प्लीफिकेशन दक्षता ९०%-११०% सम्म पुग्छ, जसको अर्थ एम्प्लीफिकेशन क्षमता राम्रो छ, र पिघल्ने वक्रमा एकल चुचुरो हुन्छ र सामान्यतया Tm>80°C हुन्छ, जसको मतलब प्रवर्द्धन विशिष्टता राम्रो छ।
 
सम्बन्धित उत्पादनहरु:
वास्तविक समय PCR Easy-SYBR GREEN I
वास्तविक समय PCR Easy-Takman