परम्परागत रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेसहरूले उच्च तापमान सहन सक्दैनन् (MMLV गतिविधिको लागि इष्टतम तापमान 37-50°C हो, र AMV 42-60°C हो)।अधिक जटिल भाइरल आरएनएलाई कम तापक्रममा सीडीएनएमा प्रभावकारी रूपमा ट्रान्सक्राइब गर्न सकिँदैन, जसले गर्दा पत्ता लगाउने दक्षता घट्छ।परम्परागत RT-qPCR लाई सामान्यतया दुई प्रमुख इन्जाइमहरू (रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेज र DNA पोलिमरेज) को सहभागिता आवश्यक हुन्छ, जसले प्रतिक्रिया प्रणालीको सञ्चालनलाई सरल बनाउन र लागत घटाउन असम्भव बनाउँछ।यहाँ हामी दुई उच्च-तापमान प्रतिरोधी रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेसहरू, TtH र RevTaq प्रस्तुत गर्नेछौं।यी दुई इन्जाइमहरूमा DNA पोलिमरेजको कार्य पनि हुन्छ, त्यसैले तिनीहरूलाई द्विकार्यात्मक इन्जाइमहरू भनिन्छ।

TtH DNA पोलिमरेज

तपाईंले TtH को बारेमा सुन्नु भएको होला, जुन थर्मोफिलिक ब्याक्टेरियम थर्मस थर्मोफिलस HB8 बाट उत्पन्न भएको हो।Mg2+ जस्ता divalent cations को उपस्थितिमा, यसमा DNA पोलिमरेज गतिविधि हुन्छ।यो व्यापक रूपमा Taq इन्जाइम जस्ता PCR प्रतिक्रियाहरूमा प्रयोग गरिन्छ, तर यसमा Taq इन्जाइम भन्दा उच्च ताप प्रतिरोध छ, त्यसैले यसले उच्च GC सामग्री टेम्प्लेटहरूको साथ PCR मा पनि राम्रो प्रभाव पार्छ।

· यो इन्जाइममा मूलतया 3′→5′ exonuclease गतिविधि र 5′→3′ exonuclease गतिविधि हुँदैन, त्यसैले यसलाई डिडियोक्सी अनुक्रमणिका लागि पनि प्रयोग गर्न सकिन्छ।

· यो इन्जाइममा RTase गतिविधि हुन्छ।Mn2+ को उपस्थितिमा, RTase गतिविधि बढाइनेछ।यो सुविधा प्रयोग गरेर, यसलाई रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन प्रतिक्रिया र PCR प्रतिक्रिया एउटै ट्यूबमा, अर्थात्, एक-चरण RT-PCR गर्न प्रयोग गर्न सकिन्छ।यद्यपि, Mn2+ को उपस्थितिमा, RT-PCR को शुद्धता उच्च छैन।RT गतिविधि rnaase H गतिविधिसँग कुनै सरोकार छैन।

· Tth-DNA पोलिमरेज (pH9, इष्टतम +55℃～+70℃, अधिकतम +95℃) को बढ्दो गतिविधिले RNA माध्यमिक संरचनाले गर्दा हुने समस्याहरूलाई पार गर्छ।परिणामस्वरूप cDNA लाई Mg2+ आयनहरूको उपस्थितिमा समान इन्जाइमको साथ PCR द्वारा एम्प्लीफाइड गर्न सकिन्छ।

· उच्च तापक्रममा रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन र डीएनए एम्प्लीफिकेशन गर्न Tth-DNA पोलिमरेजको क्षमताले यो इन्जाइमलाई मात्रात्मक RT-PCR, क्लोनिङ, र सेलुलर र भाइरल आरएनएको जीन अभिव्यक्ति विश्लेषणको लागि उपयोगी बनाउँछ।
· Tth-DNA पोलिमरेज RT-PCR को लागि RNA लाई 1kb सम्म विस्तार गर्न प्रयोग गरिन्छ।

सुविधाहरू र फाइदाहरू

Tth DNA पोलिमरेज:

• RT-PCR प्रतिक्रियामा अप्टिमाइज्ड पोलिमरेज चेन रियाक्सन (PCR) उत्पादन साइज, कम्तिमा 1000 bp सुनिश्चित गर्नुहोस्।

• परिमार्जित डिओक्साइरिबोन्यूक्लियोसाइड ट्राइफोस्फेटलाई सब्सट्रेटको रूपमा स्वीकार गर्नुहोस्

• RNase H गतिविधिसँग सम्बन्धित छैन

• समस्याहरू हटाउन उच्च थर्मल स्थिरता छ, सामान्यतया RNA मा उपस्थित उच्च माध्यमिक संरचनासँग सम्बन्धित

RevTaq RT-PCR DNA पोलिमरेज

रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेस गतिविधिको साथ गर्मी प्रतिरोधी DNA पोलिमरेज

RevTaq-RT-PCR-DNA पोलिमरेज एक ईन्जिनियर गरिएको, अत्यधिक गर्मी-प्रतिरोधी, दोहोरो-कार्यात्मक इन्जाइम हो जसको रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेज र DNA पोलिमरेज गतिविधिहरू निर्देशित र कृत्रिम विकास मार्फत प्राप्त गरिन्छ।

· RevTaq RT-PCR DNA पोलिमरेजको आधा-जीवन 95°C मा 40 मिनेट भन्दा बढी हुन्छ।

· RevTaq RT-PCR DNA पोलिमरेजले RNA टेम्प्लेटबाट सीधै उच्च-तापमान रिभर्स ट्रान्सक्रिप्सनलाई अनुमति दिन्छ, र थप cDNA टेम्प्लेटहरू उत्पन्न गर्न रिभर्स ट्रान्सक्रिप्सन चरण धेरै पटक दोहोर्याउन सकिन्छ।

· RevTaq RT-PCR DNA पोलिमरेजले "शून्य-चरण" RT-PCR (कुनै आइसोथर्मल रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन स्टेप छैन) लाई अनुमति दिन्छ, किनभने चक्रीय PCR विस्तार चरणमा, रिभर्स ट्रान्सक्रिप्सन र DNA एम्प्लीफिकेशन एकैसाथ हुन्छ।यसले उच्च तापक्रममा रिभर्स ट्रान्सक्रिप्सन प्रतिक्रियालाई पनि बढावा दिन्छ, जसले गर्दा उच्च तापक्रममा आरएनएमा बलियो माध्यमिक संरचना पग्लनमा सामना गर्ने समस्याहरूलाई कम गर्छ।

· aptamer-आधारित हट-स्टार्ट सूत्रको कारण, RevTaq RT-PCR DNA पोलिमरेजले एनिलिङ र एक्स्टेन्सन तापमान 57 डिग्री सेल्सियस भन्दा माथि हुँदा राम्रो परिणामहरू उत्पादन गर्नेछ।

· इन्जाइम तातो प्रतिरोधी भएकोले, धेरै उच्च पग्लने बिन्दुहरू (>60 डिग्री सेल्सियस) भएका प्राइमरहरू र प्रोबहरू डिजाइन गर्न सिफारिस गरिन्छ।

· प्रतिक्रिया सेटअप प्रक्रियाको क्रममा तापमान ढाँचा मार्फत एनेलिङ/एक्सटेन्सन चरणको तापक्रम अनुकूलन गर्न सिफारिस गरिन्छ।

· तापक्रम जति बढी हुन्छ, PCR को विशिष्टता त्यति नै बढी हुन्छ।रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन चक्र सामान्यतया PCR चक्र भन्दा उच्च तापक्रममा गरिन्छ, किनभने DNA प्राइमर:RNA टेम्प्लेट हाइब्रिडाइजेशनमा सामान्यतया DNA प्राइमर:cDNA टेम्प्लेट डुप्लेक्स भन्दा उच्च पिघलने बिन्दु हुन्छ।

· RevTaq RT-PCR DNA पोलिमरेज आनुवंशिक रूपमा इन्जिनियर गरिएको छ र अप्टिमाइज गरिएको छ, र एम्प्लिकन साइज 60-300 bp को बीचमा छ।

RevTaq RT-PCR DNA पोलिमरेज पत्ता लगाउने सीमा 4 प्रतिहरू पुग्छ/

अनुकूलित प्रतिक्रिया प्रणाली (उच्च पिघलने बिन्दु प्राइमरों को स्थापना) चित्र मा देखाइएको छ।RevTaq RT-PCR DNA पोलिमरेज-संचालित RT-PCR ले TaqPath 1-चरण RT-qPCR मास्टर मिक्स भन्दा राम्रो संवेदनशीलता देखाउँदछ, र कम पत्ता लगाउने नमूना कमजोर ढाल।

थप फाइदाहरू:

द्रुत सुरुवात प्रकार्य → प्रारम्भिक थर्मल विकृतीकरण चरण छोड्न सकिन्छ।

हट-स्टार्ट एपटेमर सूत्र → १००% इन्जाइम गतिविधि तुरुन्तै उपलब्ध गराउनुहोस् र कम तापक्रम (<57°C) मा गैर-विशिष्ट प्रवर्धन रोक्नुहोस्।

क्लीभेज प्रकार्य → RNA निकासी चरण हटाइयो, किनभने RevTaq RT-PCR DNA पोलिमरेजले कच्चा प्रतिक्रिया नमूनाहरू पनि प्रशोधन गर्न सक्छ।यसले तुरुन्तै तातो RT-PCR चक्रमा युकेरियोट्स, ब्याक्टेरिया र भाइरसहरूको सेल झिल्ली नष्ट गर्न सक्छ।

IVD कच्चा माल स्तर → उच्च गुणस्तर मापदण्ड र अत्यधिक प्रतिस्पर्धी मूल्यहरु