1. आधारभूत ज्ञान (यदि तपाइँ प्रयोगात्मक भाग हेर्न चाहनुहुन्छ भने, कृपया दोस्रो भागमा सिधै स्थानान्तरण गर्नुहोस्)

परम्परागत PCR को एक व्युत्पन्न प्रतिक्रिया को रूप मा, वास्तविक समय PCR ले मुख्य रूप देखि PCR प्रवर्धन प्रतिक्रिया को प्रत्येक चक्र मा प्रतिदीप्ति संकेत को परिवर्तन को माध्यम बाट एम्प्लिफिकेशन उत्पादन को मात्रा को परिवर्तन को निगरानी गर्दछ, र मात्रात्मक रूप मा ct मान र मानक वक्र को बीच सम्बन्ध को माध्यम बाट सुरु टेम्प्लेट को विश्लेषण गर्दछ।

RT-PCR को विशिष्ट डाटा होआधार रेखा, प्रतिदीप्ति थ्रेसहोल्डरCt मान।

RT-PCR को लागि सामान्य लेबलिंग विधिहरू:

२. प्रयोगात्मक चरणहरू

2.1 प्रयोगात्मक समूहको बारेमा- समूहमा धेरै कुवाहरू हुनुपर्दछ, र जैविक पुनरावृत्तिहरू हुनुपर्छ।

२.२ प्राइमर डिजाइनका सिद्धान्तहरू

①SiRNA प्रजाति-विशिष्ट हो, र विभिन्न प्रजातिहरूको अनुक्रम फरक हुनेछ।

②SiRNA फ्रिज-ड्राइड पाउडरमा प्याकेज गरिन्छ, जुन कोठाको तापक्रममा २-४ हप्तासम्म स्थिर रूपमा भण्डारण गर्न सकिन्छ।

2.3 उपकरण वा अभिकर्मकहरू जुन पहिले नै तयार हुनुपर्छ

2.4 विशेष प्रयोगात्मक चरणहरूमा ध्यान दिनु पर्ने मुद्दाहरूको सम्बन्धमा:

①siRNA ट्रान्सफेक्सन प्रक्रिया

1. प्लेटिङको लागि, तपाइँ 24-वेल प्लेट, 12-वेल प्लेट वा 6-वेल प्लेट (24-वेल प्लेटको प्रत्येक इनारमा प्रस्तावित औसत RNA एकाग्रता लगभग 100-300 ng/uL छ) छनोट गर्न सक्नुहुन्छ, र सेलहरूको इष्टतम ट्रान्सफेक्सन घनत्व 60% -80% सम्म हुन्छ।

2. ट्रान्सफेक्सन चरणहरू र विशिष्ट आवश्यकताहरू कडाईका साथ निर्देशनहरू अनुरूप छन्।

3. ट्रान्सफेक्सन पछि, mRNA पत्ता लगाउन (RT-PCR) वा प्रोटिन पत्ता लगाउन 48-96 घण्टा भित्र नमूनाहरू 24-72 घण्टा भित्र सङ्कलन गर्न सकिन्छ (WB)

② आरएनए निकासी प्रक्रिया

1. exogenous इन्जाइमहरू द्वारा प्रदूषण रोक्नुहोस्।यसमा मुख्यतया मास्क र पञ्जा लगाउने कडाई समावेश छ;बाँझ पिपेट टिपहरू र EP ट्यूबहरू प्रयोग गर्दै;प्रयोगमा प्रयोग गरिएको पानी RNase-मुक्त हुनुपर्छ।

2. द्रुत निकासी किटमा सुझाव दिए अनुसार दुई पटक गर्न सिफारिस गरिन्छ, जसले वास्तवमा शुद्धता र उपजमा सुधार गर्नेछ।

3. फोहोरको तरल पदार्थले आरएनए स्तम्भलाई छुनु हुँदैन।

③ RNA परिमाणीकरण

आरएनए निकालेपछि, यसलाई Nanodrop मार्फत सीधै मात्रा निर्धारण गर्न सकिन्छ, र न्यूनतम पठन 10ng/ul को रूपमा कम हुन सक्छ।

④ रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन प्रक्रिया

1. RT-qPCR को उच्च संवेदनशीलताको कारणले, प्रत्येक नमूनाको लागि कम्तिमा 3 समानान्तर कुवाहरू बनाइनु पर्छ ताकि पछिको Ct धेरै फरक हुनबाट वा SD सांख्यिकीय विश्लेषणको लागि धेरै ठूलो हुन नदिन।

2. मास्टर मिक्सलाई बारम्बार फ्रिज नगर्नुहोस् र पगाल्नुहोस्।

3. प्रत्येक ट्यूब/प्वाललाई नयाँ टिपले प्रतिस्थापन गर्नुपर्छ!नमूनाहरू थप्न लगातार उही पिपेट टिप प्रयोग नगर्नुहोस्!

4. नमूना थपेपछि 96-वेल प्लेटमा जोडिएको फिल्मलाई प्लेटको साथ चिकनी गर्न आवश्यक छ।यसलाई मेसिनमा राख्नु अघि सेन्ट्रीफ्यूज गर्नु राम्रो हुन्छ, ताकि ट्यूबको भित्तामा रहेको तरल पदार्थ तल बगेर हावाका बुलबुले हटाउन सकोस्।

⑤सामान्य वक्र विश्लेषण

2.5 डाटा विश्लेषण बारे

qPCR को डेटा विश्लेषणलाई सापेक्ष परिमाणीकरण र पूर्ण मात्रामा विभाजन गर्न सकिन्छ।उदाहरण को लागी, नियन्त्रण समूह मा कोशिकाहरु संग तुलना उपचार समूह मा कोशिकाहरु,

X जीनको mRNA कति पटक परिवर्तन हुन्छ, यो सापेक्ष मात्रा हो;कोशिकाहरूको निश्चित संख्यामा, X जीनको mRNA

त्यहाँ कति प्रतिलिपिहरू छन्, यो पूर्ण मात्रा हो।सामान्यतया हामीले प्रयोगशालामा सबैभन्दा धेरै प्रयोग गर्ने सापेक्ष मात्रात्मक विधि हो।सामान्यतया,2-ΔΔct विधिप्रयोगहरूमा सबैभन्दा बढी प्रयोग गरिन्छ, त्यसैले यो विधि यहाँ विस्तृत रूपमा प्रस्तुत गरिनेछ।

2-ΔΔct विधि: प्राप्त परिणाम नियन्त्रण समूह मा लक्षित जीन सापेक्ष प्रयोगात्मक समूह मा लक्ष्य जीन को अभिव्यक्ति मा भिन्नता छ।यो आवश्यक छ कि लक्ष्य जीन र आन्तरिक सन्दर्भ जीन दुवैको प्रवर्धन क्षमताहरू 100% नजिक छ, र सापेक्ष विचलन 5% भन्दा बढी हुनु हुँदैन।

गणना विधि निम्नानुसार छ:

Δct नियन्त्रण समूह = नियन्त्रण समूहमा लक्ष्य जीनको सीटी मूल्य - नियन्त्रण समूहमा आन्तरिक सन्दर्भ जीनको सीटी मूल्य

Δct प्रयोगात्मक समूह = प्रयोगात्मक समूहमा लक्षित जीनको ct मान - प्रयोगात्मक समूहमा आन्तरिक सन्दर्भ जीनको ct मान

ΔΔct = Δct प्रयोगात्मक समूह-Δct नियन्त्रण समूह

अन्तमा, अभिव्यक्ति स्तरमा भिन्नताको गुणक गणना गर्नुहोस्:

Fold=2-ΔΔct परिवर्तन गर्नुहोस् (एक्सेल प्रकार्यसँग सम्बन्धित POWER हो)

सम्बन्धित उत्पादनहरु:

सेल प्रत्यक्ष RT-qPCR किट