一, प्रतिक्रिया प्रणालीको संवेदनशीलता बढाउनुहोस्:

1. उच्च गुणस्तरको आरएनए अलग गर्नुहोस्:

सफल cDNA संश्लेषण उच्च गुणस्तरको आरएनए बाट आउँछ।उच्च-गुणस्तरको आरएनए कम्तिमा पूर्ण-लम्बाइ र रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेज अवरोधकहरू जस्तै EDTA वा SDS रहित हुनुपर्छ।RNA को गुणस्तरले तपाईले cDNA मा ट्रान्सक्राइब गर्न सक्नुहुने अनुक्रम जानकारीको अधिकतम मात्रा निर्धारण गर्दछ।एक साधारण आरएनए शुद्धिकरण विधि गुआनिडाइन आइसोथियोसाइनेट/एसिड फिनोल प्रयोग गरेर एक-चरण विधि हो।RNase को ट्रेस मात्राहरू द्वारा प्रदूषण रोक्नको लागि, RNase-सम्पन्न नमूनाहरू (जस्तै प्यान्क्रियाज) बाट पृथक गरिएको RNA उच्च गुणस्तरको RNA सुरक्षित गर्न, विशेष गरी दीर्घकालीन भण्डारणको लागि फर्मल्डिहाइडमा भण्डारण गर्न आवश्यक छ।मुसाको कलेजोबाट निकालिएको आरएनए एक सातासम्म पानीमा राखेपछि मूलतः घटेको थियो भने मुसाको प्लीहाबाट निकालिएको आरएनए ३ वर्षसम्म पानीमा राखेपछि स्थिर रह्यो ।थप रूपमा, 4 kb भन्दा लामो ट्रान्सक्रिप्टहरू साना ट्रान्सक्रिप्टहरू भन्दा ट्रेस RNases द्वारा गिरावटको लागि बढी संवेदनशील हुन्छन्।भण्डारण गरिएको आरएनए नमूनाहरूको स्थिरता बढाउनको लागि, आरएनएलाई डियोनाइज्ड फोरमाइडमा विघटन गर्न सकिन्छ र -70 डिग्री सेल्सियसमा भण्डारण गर्न सकिन्छ।आरएनए जोगाउन प्रयोग गरिने फर्मामाइड आरएनए-डिग्रेडिङ फोहोरबाट मुक्त हुनुपर्छ।प्यान्क्रियाजबाट प्राप्त आरएनए कम्तिमा एक वर्षको लागि फर्मामाइडमा सुरक्षित गर्न सकिन्छ।RNA प्रयोग गर्ने तयारी गर्दा, तपाईंले RNA को प्रक्षेपण गर्न निम्न विधि प्रयोग गर्न सक्नुहुन्छ: ०.२M मा NaCl थप्नुहोस् र इथानोलको भोल्युमको ४ गुणा, ३-५ मिनेटको लागि कोठाको तापक्रममा राख्नुहोस् र ५ मिनेटको लागि १०,००० ×g मा सेन्ट्रीफ्यूज गर्नुहोस्।

2. RNaseH-inactive (RNaseH-) रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेस प्रयोग गर्नुहोस्:

CDNA संश्लेषणको लम्बाइ र उपज बढाउनको लागि RNase अवरोधकहरू प्राय: उल्टो ट्रान्सक्रिप्शन प्रतिक्रियाहरूमा थपिन्छन्।RNase अवरोधकहरू बफर र घटाउने एजेन्ट (जस्तै DTT) को उपस्थितिमा पहिलो-स्ट्र्यान्ड संश्लेषण प्रतिक्रियाको समयमा थपिनुपर्छ, किनभने cDNA संश्लेषण अघिको प्रक्रियाले अवरोधकलाई खण्डन गर्छ, जसले RNA लाई घटाउन सक्ने बाध्य RNase रिलिज गर्छ।प्रोटीन RNase अवरोधकहरूले RNase A, B, C द्वारा RNA को पतनलाई मात्र रोक्छ, र छालामा RNase रोक्दैन, त्यसैले यी अवरोधकहरूको प्रयोगको बाबजुद पनि आफ्नो औंलाहरूबाट RNase परिचय नगर्न सावधान रहनुहोस्।

रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेजले आरएनएलाई सीडीएनएमा रूपान्तरण गर्न उत्प्रेरित गर्दछ।M-MLV र AMV दुबैको आफ्नै पोलिमरेज गतिविधिको अतिरिक्त अन्तर्जात RNaseH गतिविधि छ।RNaseH गतिविधि र पोलिमरेज गतिविधिले RNA टेम्प्लेट र DNA प्राइमर वा cDNA एक्सटेन्सन स्ट्र्यान्ड बीचको हाइब्रिड स्ट्र्यान्डको लागि एकअर्कासँग प्रतिस्पर्धा गर्छ, र RNA:DNA कम्प्लेक्समा RNA स्ट्र्यान्डलाई घटाउँछ।RNaseH गतिविधि द्वारा अपमानित RNA टेम्प्लेटले अब cDNA संश्लेषणको लागि प्रभावकारी सब्सट्रेटको रूपमा काम गर्न सक्दैन, जसले cDNA संश्लेषणको उपज र लम्बाइ घटाउँछ।त्यसकारण, रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेजको RNaseH गतिविधिलाई हटाउन वा धेरै कम गर्न लाभदायक हुनेछ।

सुपरस्क्रिप्ट Ⅱ रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेज, RNaseH- MMLV रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेज र थर्मोस्क्रिप्ट रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेज, RNaseH- AMV, MMLV र AMV भन्दा बढी मात्रा र पूर्ण-लम्बाइको cDNA प्राप्त गर्न सक्छ।RT-PCR संवेदनशीलता cDNA संश्लेषण को मात्रा द्वारा प्रभावित हुनेछ।ThermoScript AMV भन्दा धेरै संवेदनशील छ।RT-PCR उत्पादनहरूको आकार सीडीएनए संश्लेषण गर्न रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेजको क्षमताद्वारा सीमित हुन्छ, विशेष गरी जब ठूला cDNAs क्लोनिङ गर्दा।MMLV सँग तुलना गर्दा, SuperScripⅡ ले लामो RT-PCR उत्पादनहरूको उपजमा उल्लेखनीय वृद्धि गरेको छ।RNaseH-रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेजले पनि थर्मोस्टेबिलिटी बढाएको छ, त्यसैले प्रतिक्रिया सामान्य 37-42 डिग्री सेल्सियस भन्दा बढी तापमानमा प्रदर्शन गर्न सकिन्छ।सुझाव गरिएका संश्लेषण अवस्थाहरूमा, oligo(dT) प्राइमर र [α-P]dCTP को 10 μCi प्रयोग गर्नुहोस्।पहिलो स्ट्र्यान्डको कुल उपज TCA वर्षा विधि प्रयोग गरेर गणना गरिएको थियो।पूर्ण-लम्बाइको सीडीएनए आकार-क्रमबद्ध ब्यान्डहरू प्रयोग गरी विश्लेषण गरिएको थियो र क्षारीय एगारोज जेलमा गणना गरियो।

3. रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शनको लागि इन्क्युबेशन तापमान बढाउनुहोस्:

उच्च इन्क्युबेशन तापमानले आरएनए माध्यमिक संरचना खोल्न मद्दत गर्छ, प्रतिक्रियाको उपज बढाउँछ।धेरैजसो RNA टेम्प्लेटहरूका लागि, RNA र प्राइमरहरूलाई 65°C मा बफर वा नुन बिना इन्क्युब गर्ने, त्यसपछि बरफमा द्रुत चिसोले धेरैजसो माध्यमिक संरचनाहरू हटाउँछ र प्राइमरहरूलाई बाँध्न अनुमति दिन्छ।यद्यपि, केहि टेम्प्लेटहरूमा अझै पनि माध्यमिक संरचनाहरू छन्, तापनि विकृतिकरण पछि पनि।यी कठिन टेम्प्लेटहरूको प्रवर्धन थर्मोस्क्रिप्ट रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेस प्रयोग गरेर प्रदर्शन गर्न सकिन्छ र प्रवर्द्धन सुधार गर्न उच्च तापमानमा रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन प्रतिक्रिया राखेर।उच्च इन्क्युबेशन तापमानले पनि विशिष्टता बढाउन सक्छ, विशेष गरी जब सीडीएनए संश्लेषणको लागि जीन-विशिष्ट प्राइमरहरू (GSP) प्रयोग गरिन्छ (अध्याय 3 हेर्नुहोस्)।यदि GSP प्रयोग गर्दै हुनुहुन्छ भने, सुनिश्चित गर्नुहोस् कि प्राइमरहरूको Tm अपेक्षित इन्क्युबेशन तापक्रम जस्तै हो।60 डिग्री सेल्सियस भन्दा माथि ओलिगो(डीटी) र अनियमित प्राइमरहरू प्रयोग नगर्नुहोस्।अनियमित प्राइमरहरूलाई 60 डिग्री सेल्सियसमा बढाउनु अघि 10 मिनेटको लागि 25 डिग्री सेल्सियसमा इन्क्युबेशन चाहिन्छ।उच्च रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन तापक्रम प्रयोग गर्नुको अतिरिक्त, RNA/प्राइमर मिक्सलाई 65°C denaturation तापमानबाट रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन इन्क्युबेशन तापक्रममा सिधै स्थानान्तरण गरेर र पूर्व-तातो 2× प्रतिक्रिया मिश्रण (cDNA हट-स्टार्ट संश्लेषण) थपेर विशिष्टता सुधार गर्न सकिन्छ।यस दृष्टिकोणले कम तापमानमा हुने अन्तरआणविक आधार जोडीलाई रोक्न मद्दत गर्दछ।RT-PCR को लागि आवश्यक धेरै तापमान स्विचन थर्मल साइकल प्रयोग गरेर सरलीकरण गर्न सकिन्छ।

Tth थर्मोस्टेबल पोलिमरेजले Mg2+ को उपस्थितिमा DNA पोलिमरेज र Mn2+ को उपस्थितिमा RNA पोलिमरेजको रूपमा कार्य गर्दछ।यसलाई 65 डिग्री सेल्सियसको अधिकतम तापक्रममा न्यानो राख्न सकिन्छ।जे होस्, PCR को समयमा Mn2+ को उपस्थितिले निष्ठा कम गर्छ, जसले Tth पोलिमरेजलाई उच्च-परिशुद्धता प्रवर्धनको लागि कम उपयुक्त बनाउँछ, जस्तै cDNA को क्लोनिङ।थप रूपमा, Tth सँग कम रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन दक्षता छ, जसले संवेदनशीलतालाई कम गर्छ, र, रिभर्स ट्रान्सक्रिप्सन र PCR एकल इन्जाइमको साथ प्रदर्शन गर्न सकिने हुनाले, रिभर्स ट्रान्सक्रिप्सन बिना नियन्त्रण प्रतिक्रियाहरू जीनोमिक DNA दूषित गर्ने cDNA प्रवर्धन उत्पादनहरू तुलना गर्न प्रयोग गर्न सकिँदैन।प्रवर्धन उत्पादनहरू अलग गरिएको थियो।

४. रिभर्स ट्रान्सक्रिप्सनलाई बढावा दिने additives:

ग्लिसरोल र DMSO सहित additives पहिलो-स्ट्र्यान्ड संश्लेषण प्रतिक्रियामा थपिन्छन्, जसले न्यूक्लिक एसिड डबल-स्ट्र्यान्डको स्थिरता कम गर्न र आरएनएको माध्यमिक संरचनालाई खोल्न सक्छ।SuperScript II वा MMLV गतिविधिलाई असर नगरी 20% ग्लिसरोल वा 10% DMSO सम्म थप्न सकिन्छ।AMV ले गतिविधिको हानि बिना 20% ग्लिसरोल पनि सहन सक्छ।SuperScriptⅡ रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन प्रतिक्रियामा RT-PCR को संवेदनशीलता बढाउनको लागि, 10% ग्लिसरोल थप्न सकिन्छ र 45 डिग्री सेल्सियसमा इन्क्युबेटेड गर्न सकिन्छ।यदि रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन प्रतिक्रिया उत्पादनको 1/10 PCR मा थपियो भने, तब एम्प्लीफिकेशन प्रतिक्रियामा ग्लिसरोलको एकाग्रता 0.4% हुन्छ, जुन PCR लाई रोक्न पर्याप्त छैन।

5. RNaseH उपचार:

PCR भन्दा पहिले RNaseH सँग cDNA संश्लेषण प्रतिक्रियाहरूको उपचारले संवेदनशीलता बढाउन सक्छ।केही टेम्प्लेटहरूको लागि, यो सोचिएको छ कि सीडीएनए संश्लेषण प्रतिक्रियामा आरएनएले एम्प्लीफिकेशन उत्पादनहरूको बन्धनलाई रोक्छ, यस अवस्थामा RNaseH उपचारले संवेदनशीलता बढाउन सक्छ।सामान्यतया, कम-प्रतिलिपि ट्युबरस शेरोसिस II जस्ता लामो पूर्ण-लम्बाइ cDNA लक्ष्य टेम्प्लेटहरू विस्तार गर्दा RNaseH उपचार आवश्यक हुन्छ।यो कठिन टेम्प्लेटको लागि, RNaseH उपचारले SuperScript II वा AMV- संश्लेषित cDNA द्वारा उत्पादित संकेतलाई बढायो।धेरैजसो RT-PCR प्रतिक्रियाहरूको लागि, RNaseH उपचार ऐच्छिक छ, किनकि 95°C मा PCR denaturation चरणले सामान्यतया RNA:DNA जटिलमा RNA लाई हाइड्रोलाइज गर्छ।

6. सानो आरएनए पत्ता लगाउने विधिको सुधार:

आरएनएको थोरै मात्रा मात्र उपलब्ध हुँदा RT-PCR विशेष गरी चुनौतीपूर्ण हुन्छ।आरएनए अलगावको समयमा वाहकको रूपमा थपिएको ग्लाइकोजनले साना नमूनाहरूको उत्पादन बढाउन मद्दत गर्दछ।RNase-मुक्त ग्लाइकोजेन Trizol थप्दा एकै समयमा थप्न सकिन्छ।ग्लाइकोजेन पानीमा घुलनशील छ र त्यसपछिको वर्षालाई मद्दत गर्न आरएनएको साथ जलीय चरणमा राख्न सकिन्छ।50 मिलीग्राम भन्दा कम तन्तु वा 106 संवर्धित कोशिकाहरूका लागि, RNase-मुक्त ग्लाइकोजनको सिफारिस गरिएको एकाग्रता 250 μg/ml हो।

सुपरस्क्रिप्ट II को प्रयोग गरेर रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन प्रतिक्रियामा एसिटाइलेटेड BSA थप्दा संवेदनशीलता बढाउन सक्छ, र RNA को सानो मात्राको लागि, SuperScript II को मात्रा घटाएर र RNaseOut nuclease inhibitor को 40 इकाइहरू थप्दा पत्ता लगाउने स्तर बढाउन सक्छ।यदि Glycogen RNA अलगाव प्रक्रियामा प्रयोग गरिन्छ भने, यो अझै पनि BSA वा RNase अवरोधक थप्न सिफारिस गरिन्छ जब SuperScript II को उल्टो ट्रान्सक्रिप्शन प्रतिक्रियाको लागि प्रयोग गरिन्छ।

二, RT-PCR विशिष्टता बढाउनुहोस्

1. CND एसिन्थेसिस:

पहिलो-स्ट्र्यान्ड cDNA संश्लेषण तीन फरक विधिहरू प्रयोग गरेर सुरु गर्न सकिन्छ, जसको सापेक्ष विशिष्टताले cDNA संश्लेषणको मात्रा र प्रकारलाई असर गर्छ।

अनियमित प्राइमर विधि तीन विधिहरू मध्ये कम्तिमा विशिष्ट थियो।छोटो, आंशिक-लम्बाइ cDNA हरू उत्पन्न गर्दै, ट्रान्सक्रिप्ट भरि धेरै साइटहरूमा प्राइमरहरू एनिल गर्छन्।यो विधि बारम्बार 5′ अन्त अनुक्रमहरू प्राप्त गर्न र माध्यमिक संरचनाको क्षेत्रहरू वा रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेजद्वारा नक्कल गर्न नसकिने टर्मिनेशन साइटहरूसँग RNA टेम्प्लेटहरूबाट cDNA प्राप्त गर्न प्रयोग गरिन्छ।सबैभन्दा लामो cDNA प्राप्त गर्न, प्रत्येक RNA नमूनामा प्राइमरको RNA र प्राइमरीको अनुपात अनुभवात्मक रूपमा निर्धारण गर्न आवश्यक छ।अनियमित प्राइमरहरूको शुरुवात एकाग्रता प्रति 20 μl प्रतिक्रिया 50 देखि 250 एनजी सम्म थियो।यादृच्छिक प्राइमरहरू प्रयोग गरेर कुल आरएनएबाट संश्लेषित सीडीएनए मुख्य रूपमा राइबोसोमल आरएनए भएको हुनाले, पोली(ए)+आरएनएलाई सामान्यतया टेम्प्लेटको रूपमा छनोट गरिन्छ।

ओलिगो (डीटी) प्राइमरहरू अनियमित प्राइमरहरू भन्दा बढी विशिष्ट हुन्छन्।यो धेरैजसो युकेरियोटिक mRNAs को 3′ छेउमा पाइने पोली(A) पुच्छरमा हाइब्रिडाइज हुन्छ।पोली(ए)+ आरएनए कुल आरएनएको लगभग १% देखि २% भएको हुनाले, सीडीएनएको मात्रा र जटिलता अनियमित प्राइमरहरूको तुलनामा धेरै कम हुन्छ।यसको उच्च विशिष्टताको कारण, oligo(dT) लाई सामान्यतया RNA को प्राइमर र Poly(A)+ चयनको अनुपातको अनुकूलन आवश्यक पर्दैन।यो 0.5μg oligo(dT) प्रति 20μl प्रतिक्रिया प्रणाली प्रयोग गर्न सिफारिस गरिन्छ।oligo(dT)12-18 धेरैजसो RT-PCR को लागि उपयुक्त छ।ThermoScript RT-PCR प्रणालीले उच्च इन्क्युबेशन तापमानको लागि यसको राम्रो थर्मल स्थिरताको कारणले oligo(dT)20 प्रदान गर्दछ।

जीन विशिष्ट प्राइमरहरू (GSP) रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन चरणको लागि सबैभन्दा विशिष्ट प्राइमरहरू हुन्।GSP एक एन्टिसेन्स ओलिगोन्यूक्लियोटाइड हो जसले विशेष रूपमा आरएनए लक्ष्य अनुक्रममा हाइब्रिडाइज गर्न सक्छ, अनियमित प्राइमर वा ओलिगो(डीटी) को विपरीत, जसले सबै आरएनएहरूलाई एनाल गर्दछ।PCR प्राइमरहरू डिजाइन गर्न प्रयोग गरिने समान नियमहरू उल्टो ट्रान्सक्रिप्शन प्रतिक्रियाहरूमा GSP को डिजाइनमा लागू हुन्छन्।GSP एमआरएनए को 3′-सबै भन्दा छेउमा एनिल गर्ने एम्प्लीफिकेशन प्राइमरको समान अनुक्रम हुन सक्छ, वा GSP लाई रिभर्स एम्प्लीफिकेशन प्राइमरको डाउनस्ट्रीम एनिल गर्न डिजाइन गर्न सकिन्छ।केही एम्प्लीफाइड विषयहरूका लागि, एक भन्दा बढी एन्टिसेन्स प्राइमरहरू सफल RT-PCR को लागि डिजाइन गर्न आवश्यक छ किनभने लक्षित RNA को माध्यमिक संरचनाले प्राइमर बाइन्डिङलाई रोक्न सक्छ।यो 20 μl पहिलो-स्ट्र्यान्ड संश्लेषण प्रतिक्रिया मा 1 pmol antisense GSP प्रयोग गर्न सिफारिस गरिएको छ।

2. रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शनको लागि इन्क्युबेशन तापमान बढाउनुहोस्:

GSP विशिष्टताको पूर्ण लाभको पूर्ण लाभ लिनको लागि, उच्च थर्मोस्टेबिलिटी भएको रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेस प्रयोग गरिनुपर्छ।थर्मोस्टेबल रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेसहरूलाई प्रतिक्रिया कठोरता बढाउन उच्च तापमानमा इन्क्युबेटेड गर्न सकिन्छ।उदाहरणका लागि, यदि GSP 55°C मा एनिल हुन्छ भने, AMV वा M-MLV लाई 37°C को कम कठोरतामा रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शनको लागि प्रयोग गरिएमा GSP को विशिष्टता पूर्ण रूपमा प्रयोग गरिने छैन।यद्यपि, SuperScript II र ThermoScript 50°C वा उच्चमा प्रतिक्रिया गर्न सकिन्छ, जसले कम तापक्रममा उत्पन्न हुने गैर-विशिष्ट उत्पादनहरूलाई हटाउनेछ।अधिकतम विशिष्टताको लागि, RNA/प्राइमर मिक्सलाई 65°C denaturation तापमानबाट रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन इन्क्युबेशन तापक्रममा सिधै स्थानान्तरण गर्न सकिन्छ र पूर्व-तातो 2× प्रतिक्रिया मिश्रण (cDNA संश्लेषण हट स्टार्ट) मा थप्न सकिन्छ।यसले कम तापमानमा इन्टरमोलिक्युलर आधार जोडीलाई रोक्न मद्दत गर्दछ।RT-PCR को लागि आवश्यक धेरै तापक्रम ट्रान्जिसनहरू थर्मल साइकल प्रयोग गरेर सरलीकृत गर्न सकिन्छ।

3. जीनोमिक डीएनए प्रदूषण घटाउँछ:

RT-PCR ले सामना गरेको सम्भावित कठिनाई भनेको आरएनएमा जीनोमिक डीएनएको प्रदूषण हो।Trizol Reagent जस्ता राम्रो RNA पृथक विधिको प्रयोगले RNA को तयारीलाई दूषित गर्ने जीनोमिक DNA को मात्रा कम गर्नेछ।जीनोमिक DNA बाट व्युत्पन्न उत्पादनहरूबाट बच्नको लागि, RNA लाई प्रवर्द्धन-ग्रेड DNase I सँग उपचार गर्न सकिन्छ र उल्टो ट्रान्सक्रिप्सन अघि दूषित DNA हटाउन सकिन्छ।DNase I पाचन 65 डिग्री सेल्सियसमा 10 मिनेटको लागि 2.0 mM EDTA मा नमूनाहरू इन्क्युबट गरेर समाप्त भयो।EDTA ले म्याग्नेसियम आयनहरू चेलेट गर्न सक्छ, उच्च तापमानमा म्याग्नेसियम आयन-निर्भर आरएनए हाइड्रोलाइसिसलाई रोक्न सक्छ।

एम्प्लीफाइड cDNA लाई दूषित जीनोमिक DNA एम्प्लीफिकेशन उत्पादनहरूबाट अलग गर्न, प्राइमरहरू डिजाइन गर्न सकिन्छ कि प्रत्येक एनाललाई एक्सोनहरू अलग गर्न सकिन्छ।cDNA बाट व्युत्पन्न PCR उत्पादनहरू दूषित जीनोमिक DNA बाट व्युत्पन्न भन्दा छोटो हुनेछ।थप रूपमा, दिइएको खण्ड जीनोमिक DNA वा cDNA बाट व्युत्पन्न गरिएको हो कि भनेर निर्धारण गर्न प्रत्येक आरएनए टेम्प्लेटमा उल्टो ट्रान्सक्रिप्सन बिना नियन्त्रण प्रयोग गरिएको थियो।रिभर्स ट्रान्सक्रिप्सन बिना प्राप्त पीसीआर उत्पादन जीनोमबाट व्युत्पन्न हुन्छ।