प्रयोगशालामा नयाँको रूपमा, कम रूपान्तरण दर भएका बिरुवाहरूको गुच्छाबाट सकारात्मक बिरुवाहरू स्क्रिन गर्नु राम्रो काम होइन।पहिले, एक एक गरेर ठूलो संख्यामा नमूनाहरूबाट डीएनए निकाल्नुपर्छ, त्यसपछि विदेशी जीनहरू पीसीआरद्वारा पत्ता लगाइनेछ।यद्यपि, नतिजाहरू प्रायः खाली र कहिलेकाहीं केही वस्तुहरू भएका ब्यान्डहरू हुन्छन्, तर छुटेका पत्ताहरू वा गलत पत्ता लगाउनेहरू छन् कि छैनन् भनेर निर्धारण गर्न असम्भव छ।।के यस्तो प्रयोगात्मक प्रक्रिया र परिणामहरूको सामना गर्न धेरै असहाय छ?चिन्ता नगर्नुहोस्, भाइले तपाईलाई ट्रान्सजेनिक सकारात्मक बिरुवाहरू सजिलै र सही रूपमा कसरी स्क्रिन गर्ने भनेर सिकाउनुहुन्छ।

चरण 1

डिजाइन पत्ता लगाउने प्राइमरहरू

परीक्षण गरिनु पर्ने नमूना अनुसार पत्ता लाग्ने अन्तर्जात जीन र एक्सोजेनस जीन निर्धारण गर्नुहोस्, र प्राइमर डिजाइनको लागि जीनमा प्रतिनिधि 100-500bp अनुक्रम चयन गर्नुहोस्।राम्रो प्राइमरहरूले पत्ता लगाउने नतिजाहरूको शुद्धता सुनिश्चित गर्न र पत्ता लगाउने समय छोटो बनाउन सक्छ (सामान्यतया प्रयोग हुने पत्ता लगाउने प्राइमरहरूको लागि परिशिष्ट हेर्नुहोस्)।

नोटिस: नयाँ डिजाइन गरिएका प्राइमरहरूले प्रतिक्रिया अवस्थाहरू अनुकूलन गर्न आवश्यक छ र ठूला-ठूला पत्ता लगाउनु अघि पहिचानको शुद्धता, सटीकता र पत्ता लगाउने सीमा प्रमाणित गर्न आवश्यक छ।

चरण २

डिजाइन प्रयोगात्मक प्रोटोकल

सकारात्मक नियन्त्रण: PCR प्रतिक्रिया प्रणाली र अवस्था सामान्य छ कि भनेर निर्धारण गर्न टेम्प्लेटको रूपमा लक्ष्य टुक्रा भएको शुद्ध DNA प्रयोग गर्नुहोस्।

नकारात्मक/खाली नियन्त्रण: DNA टेम्प्लेट वा ddH2O प्रयोग गर्नुहोस् जसमा PCR प्रणालीमा प्रदूषणको स्रोत छ कि छैन भनेर पत्ता लगाउन टेम्प्लेटको रूपमा लक्षित टुक्रा समावेश छैन।

आन्तरिक सन्दर्भ नियन्त्रण: नमूनाको अन्तर्जात जीनको प्राइमर/प्रोब संयोजन प्रयोग गर्नुहोस् कि टेम्प्लेट PCR द्वारा पत्ता लगाउन सकिन्छ कि भनेर मूल्याङ्कन गर्न परीक्षण गर्न।

सूचना:

प्रयोगात्मक परिणामहरूको वैधता मूल्याङ्कन गर्न प्रत्येक परीक्षणको लागि सकारात्मक, नकारात्मक/खाली नियन्त्रणहरू र आन्तरिक नियन्त्रण नियन्त्रणहरू सेट गरिनुपर्छ।

प्रयोगको तयारी

प्रयोग गर्नु अघि, समाधान समान रूपमा मिश्रित छ कि छैन हेर्नुहोस्।यदि वर्षा फेला पर्यो भने, यसलाई प्रयोग गर्नु अघि निर्देशनहरू अनुसार भंग र मिश्रित गर्न आवश्यक छ।2×PCR मिक्सलाई असमान आयन वितरणबाट बच्न प्रयोग गर्नु अघि एक माइक्रोपिपेटसँग बारम्बार पाइपेट गरी मिसाउनु पर्छ।

सूचना:

म्यानुअल निकाल्नुहोस् र यसलाई ध्यानपूर्वक पढ्नुहोस्, र म्यानुअलको आवश्यकताहरू अनुसार कडाईका साथ प्रयोग गर्नु अघि तयारी गर्नुहोस्।

चरण 4

PCR प्रतिक्रिया प्रणाली तयार गर्नुहोस्

प्रयोगात्मक प्रोटोकल अनुसार, प्राइमरहरू, H2O, र 2×PCR मिश्रणलाई समान रूपमा मिलाउनुहोस्, सेन्ट्रीफ्यूज गर्नुहोस् र तिनीहरूलाई प्रत्येक प्रतिक्रिया ट्यूबमा वितरण गर्नुहोस्।

सूचना:

ठूलो मात्रामा वा दीर्घकालीन परीक्षणको लागि, UNG इन्जाइम भएको PCR प्रतिक्रिया प्रणाली प्रयोग गर्न सिफारिस गरिन्छ, जसले प्रभावकारी रूपमा PCR उत्पादनहरूबाट हुने एरोसोल प्रदूषणबाट बच्न सक्छ।

चरण 5

प्रतिक्रिया टेम्प्लेट थप्नुहोस्

डायरेक्ट पीसीआर प्रविधि प्रयोग गरेर, कठिन न्यूक्लिक एसिड शुद्धिकरण प्रक्रियाको आवश्यकता पर्दैन, नमूना टेम्प्लेट १० मिनेट भित्र तयार गर्न सकिन्छ, र सम्बन्धित PCR प्रतिक्रिया प्रणाली थप्न सकिन्छ।

सूचना:

क्लीभेज विधिमा राम्रो पत्ता लगाउने प्रभाव छ, र प्राप्त उत्पादन धेरै पत्ता लगाउने प्रतिक्रियाहरूको लागि प्रयोग गर्न सकिन्छ।

5.1: पातहरूको प्रत्यक्ष विस्तार

म्यानुअलमा चित्रको साइज अनुसार 2-3 मिमी व्यासको पातको टिस्यु काट्नुहोस् र PCR प्रतिक्रिया प्रणालीमा राख्नुहोस्।

नोट: सुनिश्चित गर्नुहोस् कि पातका टुक्राहरू PCR प्रतिक्रिया समाधानमा पूर्ण रूपमा डुबेका छन्, र अत्यधिक पातको तन्तुहरू थप नगर्नुहोस्।

5.2: पात विभाजन विधि

पातको तन्तुलाई ५-७ एमएमको व्यासमा काटेर सेन्ट्रीफ्युज ट्यूबमा राख्नुहोस्।यदि तपाइँ परिपक्व पातहरू छान्नुहुन्छ भने, कृपया पातको मुख्य नसको टिश्युहरू प्रयोग नगर्नुहोस्।Pipette 50ul Buffer P1 lysate लाई सेन्ट्रीफ्यूज ट्यूबमा लाइसेटले पातको टिस्युलाई पूर्ण रूपमा डुबाउन सक्छ, यसलाई थर्मल साइक्लर वा मेटल बाथमा राख्नुहोस् र 5-10 मिनेटको लागि 95°C मा लाइसेट गर्नुहोस्।

50ul Buffer P2 neutralization समाधान थप्नुहोस् र राम्ररी मिश्रण गर्नुहोस्।परिणामस्वरूप lysate टेम्प्लेटको रूपमा प्रयोग गर्न सकिन्छ र PCR प्रतिक्रिया प्रणालीमा थप्न सकिन्छ।

नोट: टेम्प्लेटको मात्रा PCR प्रणालीको 5-10% को बीचमा छ, र 20% भन्दा बढी हुनु हुँदैन (उदाहरणका लागि, 20μl PCR प्रणालीमा, 1-2μl lysis समाधान थप्नुहोस्, 4μl भन्दा बढी होइन)।

चरण 6

PCR प्रतिक्रिया

PCR प्रतिक्रिया ट्यूब सेन्ट्रीफ्यूज गरेपछि, यसलाई प्रवर्धनको लागि PCR उपकरणमा राखिन्छ।

सूचना:

प्रतिक्रियाले प्रवर्धनको लागि गैर-शुद्ध टेम्प्लेट प्रयोग गर्दछ, त्यसैले एम्प्लीफिकेशन चक्रहरूको संख्या शुद्ध DNA टेम्प्लेट प्रयोग गर्दा भन्दा 5-10 बढी चक्र हुन्छ।

चरण 7

इलेक्ट्रोफोरेसिस पत्ता लगाउने र परिणाम विश्लेषण

M: 100bp DNA ल्याडर

1\4: शुद्ध DNA विधि

2\5: प्रत्यक्ष PCR विधि

3\6: खाली नियन्त्रण

QC:

प्रयोगमा सेट गरिएका विभिन्न नियन्त्रणहरूको परीक्षण परिणामहरूले निम्न सर्तहरू पूरा गर्नुपर्छ।अन्यथा, समस्याको कारण विश्लेषण गरिनुपर्छ, र समस्या हटिसकेपछि फेरि परीक्षण गर्नुपर्छ।

तालिका 1. विभिन्न नियन्त्रण समूहहरूको सामान्य परीक्षण परिणामहरू

*जब प्लाज्मिडलाई सकारात्मक नियन्त्रणको रूपमा प्रयोग गरिन्छ, अन्तर्जात जीन परीक्षणको नतिजा नकारात्मक हुन सक्छ

नतिजा निर्णय:

A. नमूनाको एन्डोजेनस जीनको परीक्षणको नतिजा नेगेटिभ छ, जसले सामान्य PCR पत्ता लगाउन उपयुक्त DNA नमूनाबाट निकाल्न सकिँदैन वा निकालिएको DNA मा PCR प्रतिक्रिया अवरोधकहरू समावेश छन्, र DNA फेरि निकाल्नुपर्छ।

B. नमूनाको एन्डोजेनस जीनको परीक्षणको नतिजा सकारात्मक छ, र एक्सोजेनस जीनको परीक्षणको नतिजा नेगेटिभ छ, जसले नमूनाबाट सामान्य PCR पत्ता लगाउनको लागि उपयुक्त DNA निकालिएको जनाउँछ, र नमूनामा XXX जीन फेला परेको छैन भनेर अनुमान गर्न सकिन्छ।

C. नमूनाको एन्डोजेनस जीनको परीक्षणको नतिजा सकारात्मक छ, र एक्सोजेनस जीनको परीक्षणको नतिजा सकारात्मक छ, सामान्य PCR पत्ता लगाउनको लागि उपयुक्त DNA नमूनाबाट निकालिएको छ, र नमूना DNA मा XXX जीन समावेश छ।पुष्टिकरण प्रयोगहरू थप गर्न सकिन्छ।

चरण 8

डिजाइन पत्ता लगाउने प्राइमरहरू

प्रयोग पछि, 2% सोडियम हाइपोक्लोराइट घोल र 70% इथानोल घोल प्रयोग गरी वातावरणीय प्रदूषण रोक्न प्रयोगात्मक क्षेत्र सफा गर्न।