सबैले qRT-PCR प्रयोगको सिद्धान्त, प्राइमर डिजाइन, परिणाम व्याख्या, आदि बारे कुरा गरिरहेका छन्, तर मलाई लाग्छ कि मैले तपाइँसँग qRT-PCR को प्रयोगात्मक सञ्चालन साझा गर्नुपर्छ।यो सानो छ, तर यो परिणाम को बारे मा छ।

क्यूआरटी-पीसीआर गर्नु अघि, हामीले हाम्रो आफ्नै आरएनए र सञ्चालन विधिहरू बारे स्पष्ट बुझ्नुपर्छ।आखिर, हाम्रो प्रयास मात्र अभ्यास गर्नुको सट्टा नतिजा प्राप्त गर्ने उद्देश्य हो।त्यसैले qRT-PCR गर्नु अघि, हामीले निम्न मुद्दाहरू निर्धारण गर्न आवश्यक छ (जसमध्ये केही SYBR मा मात्र लागू हुन्छन्)।

1 के तपाइँ तपाइँको आरएनए बिग्रेको छैन भन्ने निश्चित हुनुहुन्छ?

NanoDrop 2000 ले RNA को एकाग्रता र शुद्धता मात्र पत्ता लगाउन सक्छ, तर RNA को अखण्डता पत्ता लगाउन सक्दैन।

RNA (RNA Intesity Number) मानले RNA को अखण्डता प्रतिबिम्बित गर्न सक्छ, जुन Agilent 2100 Bioanalyzer प्रणाली द्वारा पत्ता लगाइएको छ।

चित्र। विभिन्न RNA नमूनाहरू (eukaryotes) को लागि RIN मानहरूको योजनाबद्ध रेखाचित्र

यद्यपि, प्रयोगशालाहरूमा सामान्यतया Agilent 2100 Bioanalyzer हुँदैन।यस अवस्थामा, हामी formaldehyde जेल मार्फत पत्ता लगाउन सक्छौं, तर RNA को कुल मात्राको लागि आवश्यकता उच्च छ, त्यसैले सबैभन्दा छिटो विधि सामान्य जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस प्रयोग गर्नु हो।यो न्यूक्लिज-मुक्त वातावरणमा हुनु आवश्यक छ, त्यसैले यो इलेक्ट्रोफोरेसिस ट्यांक, सोल बोतल, जेल कोष्ठक र DEPC पानी संग कुल्ला गर्न आवश्यक छ।agarose पनि न्यूक्लिज-मुक्त छ (जब सम्म यो ताजा खोलिएको छ), र लोडिङ बफर 1.2% जेल संग, सकेसम्म धेरै ताजा खोलिनु पर्छ।

नोट गर्नुहोस् कि जेल पूर्णतया भंग गरिनु पर्छ, अन्यथा यसले चित्रमा नमूना 9 मा देखाईएको रूपमा, असंगत ब्यान्डहरू निम्त्याउनेछ।यदि भोल्टेज धेरै उच्च छ वा धेरै लामो समयसम्म चलिरहेको छ भने तातो उत्पन्न गर्दछ र आरएनए गिरावट निम्त्याउँछ, त्यसैले भोल्टेज र समयलाई उचित रूपमा नियन्त्रण गर्नुपर्छ।थप रूपमा, जेल दौडले नमूनामा DNA अवशेष छ कि छैन भनेर पनि निर्धारण गर्न सक्छ, र डिस्पेन्सिङ कुवामा राखिएको ब्यान्डहरूको ठूलो संख्या छ कि छैन भनेर निरीक्षण गर्न सक्छ।

चित्र।आरएनए को जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस पत्ता लगाउने

2 के तपाइँ तपाइँको cDNA को एकाग्रता बारे निश्चित हुनुहुन्छ?

प्रयोगशालामा ठूला भाइहरूको अनुभव यो छ कि प्रत्येक उल्टो द्वारा प्राप्त 20 ul प्रणालीको cDNA सीधा 20X पातलो हुन्छ, जबकि पोस्ट-डक्टरल बहिनीहरू 10X पातलो हुन्छन्।म सामान्यतया परिस्थितिमा भर पर्छ।किनभने प्रत्येक व्यक्तिले उल्लेख गरेको आरएनएको गुणस्तर फरक हुन्छ, उल्टाउने स्तर पनि फरक हुन्छ, र रिभर्सल प्रविधि स्थिर नहुन सक्छ।

त्यसोभए प्रत्येक चोटि मैले उल्टो cDNA पाउँदा, म यसलाई पहिले लगभग 3 पटक पातलो गर्नेछु, र त्यसपछि RT-PCR गर्न हाउसकिपिङ जीन प्रयोग गर्नेछु, चक्रको संख्या सामान्यतया 25 चक्र हुन्छ, विशिष्ट एकाग्रता पहिचान गर्न, र त्यसपछि अन्तिम कमजोरी कारक निर्धारण गर्न।

3 के तपाइँ तपाइँको प्राइमर प्रयोग गर्न सजिलो छ भनेर निश्चित हुनुहुन्छ?

यसले qRT-PCR को पग्लने वक्र पार गर्न सक्छ, तर यो अझै पनि पैसा खर्च हुन्छ।धेरै पैसा बिना प्रयोगशालाहरूको लागि, जब तिनीहरूले धेरै प्राइमरहरू प्राप्त गर्छन्, तिनीहरूले सामान्य RT-PCR प्रयोग गरी यो एकल ब्यान्ड हो कि भनेर हेर्न र प्राइमरहरूको विशिष्टता पहिचान गर्न सक्छन्।यदि प्रयोगशालामा पैसाको कमी छैन भने, सबै प्राइमरहरूको विशिष्टता पग्लने वक्र मार्फत एक पटक पहिचान गर्न सकिन्छ।

4 के तपाइँ निश्चित हुनुहुन्छ कि तपाइँको प्रयोगात्मक अवस्थाहरू उपयुक्त छन्?

SYBR बलियो प्रकाशबाट सुरक्षित हुनुपर्छ, त्यसैले SYBR अभिकर्मक थप्दा ओभरहेड लाइट बन्द गर्ने प्रयास गर्नुहोस्, र यसलाई पूरा गर्न केवल मधुरो प्रकाश प्रयोग गर्न आवश्यक छ।

SYBR 4°C मा भण्डार गर्नुहोस्।प्रयोगमा हुँदा, फोम हुनबाट जोगिनको लागि राम्रोसँग मिलाउन बिस्तारै माथि र तल उल्टो गर्नुहोस्, र जोडदार रूपमा भंवर नगर्नुहोस्।

कतिपय साना दिदीबहिनीहरूले नमूनाहरू मिसिने डरले पीसीआर बोर्डमा अंक बनाउन रुचाउँछन्, जुन गलत हो।किनभने तपाईंका मार्करहरूले फ्लोरोसेन्ट सङ्केतहरूको सङ्कलनलाई प्रभाव पार्ने सम्भावना हुन्छ, म सामान्यतया जुनियरहरूलाई मेमोरीमा मद्दत गर्न प्रयोगात्मक नोटबुकहरू प्रयोग गर्न सिफारिस गर्छु, जस्तै तल देखाइएको छ।

चित्र।qRT-PCR नमूना लोडिङ रेखाचित्र

5 के तपाइँ निश्चित हुनुहुन्छ कि तपाइँ यसलाई सही गर्दै हुनुहुन्छ?

पन्जा लगाउने, पन्जा लगाउने, पन्जा लगाउने र महत्त्वपूर्ण कुराहरू तीन पटक भन्न नबिर्सनुहोस्।

SYBR लाई प्रकाशमा कम गर्नको लागि, म व्यक्तिगत रूपमा पहिले टेम्प्लेट थप्न चाहन्छु, जस्तै तलको चित्रमा देखाइएको छ।अनुभव अनुसार, टेम्प्लेटको सानो मात्रा थप्दा नमूना त्रुटिहरू हुन सक्छ।तसर्थ, थोरै टेम्प्लेट थप्दा भएको त्रुटिलाई कम गर्नको लागि, म सामान्यतया नमूनालाई दोब्बर गर्छु, र H2O2 थपिएको मात्रा घटाउन नमूना थप्दा रकम दोब्बर गर्छु।

चित्र।QRT-PCR लोडिङको योजनाबद्ध रेखाचित्र

त्यसपछि निम्नानुसार qRT-PCR प्रणाली कन्फिगर गर्नुहोस्।

चित्र।qRT-PCR प्रणाली तयारी रेखाचित्र

नोट: कन्फिगरेसन प्रक्रिया बरफमा गर्न आवश्यक छ।

नमूना थपेपछि, पारदर्शी सीलिंग फिल्म टाँस्नुहोस्।आफ्नो हातले पारदर्शी सीलिंग फिल्मको सतहलाई नछुने प्रयास गर्नुहोस्, केवल फिल्मको दुबै छेउमा स्पेसबाट सञ्चालन गर्नुहोस्।किनभने फिंगरप्रिन्टहरूले फ्लोरोसेन्ट संकेतहरूको सङ्कलनलाई पनि असर गर्न सक्छ।त्यसपछि नमूनालाई भित्तामा झुन्ड्याउनबाट रोक्नको लागि कम गतिमा 10 सेकेन्डको लागि तुरुन्तै सेन्ट्रीफ्यूज गर्न सेन्ट्रीफ्यूज प्रयोग गर्नुहोस्।

सम्बन्धित उत्पादनहरु:

सेल प्रत्यक्ष RT-qPCR किट

RT Easy II