COVID-19 एक संक्रामक रोग हो जुन Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Type 2 को कारणले हुन्छ। जब एक व्यक्ति संक्रमित हुन्छ, सबैभन्दा सामान्य लक्षणहरूमा ज्वरो, खोकी र सास फेर्न गाह्रो हुन्छ।

परीक्षणको लागि प्रयोग गरिएका नमूनाहरू नासोफरिन्जियल स्वाब वा ओरोफरिन्जियल स्वाबहरूद्वारा सङ्कलन गर्न सकिन्छ।

PCR भनेको के हो?

कोरोनाभाइरस पत्ता लगाउने मानक विधि पोलिमरेज चेन रियाक्सन, पीसीआर हो।यो आणविक जीवविज्ञानमा व्यापक रूपमा प्रयोग हुने विधि हो।यसले चाँडै लाखौं देखि अरबौं विशिष्ट डीएनए टुक्राहरू प्रतिलिपि गर्न सक्छ।

नयाँ कोरोनाभाइरसले धेरै लामो सिंगल-स्ट्र्यान्डेड आरएनए जीनोम समावेश गर्दछ।PCR द्वारा यी भाइरसहरू पत्ता लगाउनको लागि, RNA अणुहरूलाई तिनीहरूको पूरक DNA अनुक्रमहरूमा उल्टो ट्रान्सक्रिप्टेजद्वारा रूपान्तरण गर्नुपर्छ, र त्यसपछि नयाँ संश्लेषित DNA लाई मानक PCR प्रक्रियाहरूद्वारा विस्तारित गर्न सकिन्छ, जसलाई सामान्यतया RT-PCR भनिन्छ।

RT-PCR प्रक्रिया

आरएनए निकासी

यो विधि प्रदर्शन गर्न, भाइरल आरएनए मूलतया निकाल्नुपर्छ।विभिन्न प्रकारका आरएनए शुद्धीकरण किटहरू सुविधाजनक, छिटो र प्रभावकारी विभाजनको लागि प्रयोग गर्न सकिन्छ।

व्यावसायिक किट प्रयोग गरेर भाइरल आरएनए निकाल्न, पहिले नमूनालाई माइक्रोसेन्ट्रिफ्यूज ट्यूबमा थप्नुहोस् र त्यसपछि यसलाई लिसिस बफरसँग मिलाउनुहोस्।यो बफर अत्यधिक विकृत छ र सामान्यतया फिनोल र guanidine isothiocyanate समावेश गर्दछ।थप रूपमा, RNase अवरोधकहरू सामान्यतया लाइसिस बफरमा अक्षुण्ण भाइरल आरएनएको अलगाव सुनिश्चित गर्न उपस्थित हुन्छन्।

लाइसिस बफर थपेपछि, मिक्सिङ ट्यूबलाई पल्सद्वारा घुमाउनुहोस् र कोठाको तापक्रममा इन्क्युबेट गर्नुहोस्।त्यसपछि भाइरसलाई लाइसिस बफरद्वारा प्रदान गरिएको अत्यधिक विकृत अवस्थाहरूमा लिइन्छ।

नमूना लाइज गरिसकेपछि, शुद्धीकरण प्रक्रियाको लागि सेन्ट्रीफ्यूज ट्यूब प्रयोग गरिन्छ।नमूना सेन्ट्रीफ्यूज ट्यूबमा लोड गरिन्छ र त्यसपछि सेन्ट्रीफ्यूज गरिन्छ।

यो प्रक्रिया एक ठोस चरण निकासी विधि हो जसमा स्थिर चरणमा सिलिका जेल म्याट्रिक्स हुन्छ।

इष्टतम नुन र pH अवस्थाहरूमा, RNA अणुहरू सिलिका झिल्लीमा बाँध्छन्।

एकै समयमा, प्रोटीन र अन्य प्रदूषकहरू हटाइन्छ।

सेन्ट्रीफ्यूगेसन पछि, सेन्ट्रीफ्यूज ट्यूबलाई सफा संग्रह ट्यूबमा राख्नुहोस्, फिल्टर खारेज गर्नुहोस्, र त्यसपछि धुने बफर थप्नुहोस्।

झिल्ली मार्फत धुने बफरलाई जबरजस्ती गर्न फेरि सेन्ट्रीफ्यूजमा ट्यूब राख्नुहोस्।यसले झिल्लीबाट बाँकी रहेका सबै अशुद्धताहरू हटाउनेछ, केवल RNA लाई सिलिका जेलमा बाँध्छ।

नमूना धोए पछि, सफा माइक्रोसेन्ट्रिफ्यूज ट्यूबमा ट्यूब राख्नुहोस् र इलुसन बफर थप्नुहोस्।

त्यसपछि झिल्ली मार्फत इल्युसन बफरलाई जबरजस्ती गर्न सेन्ट्रीफ्यूज गरिन्छ।इल्युसन बफरले स्पिन स्तम्भबाट भाइरल आरएनए हटाउँछ र प्रोटिन, अवरोधक र अन्य प्रदूषकहरूबाट मुक्त आरएनए प्राप्त गर्दछ।

चरण २

मिश्रित ध्यान

भाइरल आरएनए निकालेपछि, अर्को चरण पीसीआर प्रवर्धनको लागि प्रतिक्रिया मिश्रण तयार गर्नु हो।यस चरणमा, ध्यान प्रयोग गरिन्छ।यो केन्द्रित समाधान प्रिमिक्स, रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेज, न्यूक्लियोटाइड्स, फर्वार्ड प्राइमर, रिभर्स प्राइमर, TaqMan प्रोब र DNA पोलिमरेज मिलेर बनेको प्रिमिक्स्ड केन्द्रित समाधान हो।

अन्तमा, यो प्रतिक्रिया मिश्रण पूरा गर्न, RNA टेम्प्लेट थपिएको छ।ट्यूबहरू पल्स भर्टेक्सिङद्वारा मिसाइन्छ, र त्यसपछि प्रतिक्रिया मिश्रण पीसीआर प्लेटमा लोड गरिन्छ।PCR प्लेटमा सामान्यतया 96 वटा कुवाहरू हुन्छन् र यसले एकै समयमा धेरै नमूनाहरू विश्लेषण गर्न सक्छ।

चरण ३

पीसीआर प्रवर्धन

अर्को, PCR मेसिनमा प्लेट राख्नुहोस्, जुन अनिवार्य रूपमा थर्मल साइकल हो।

रियल-टाइम RT-PCR लाई RdrRP जीन, ई जीन र एन जीनमा लक्ष्य अनुक्रम विस्तार गरेर 2019 उपन्यास कोरोनाभाइरस पत्ता लगाउन प्रयोग गरिन्छ।लक्ष्य जीनको छनोट प्राइमर र प्रोब अनुक्रममा निर्भर गर्दछ।

RT-PCR को पहिलो चरण रिभर्स ट्रान्सक्रिप्सन हो।पूरक DNA को पहिलो स्ट्र्यान्ड संश्लेषित गरिन्छ, जुन PCR रिभर्स प्राइमर द्वारा सुरु हुन्छ, जुन भाइरल आरएनए जीनोमको पूरक भागमा बाँधिन्छ।त्यसपछि रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेजले भाइरल आरएनएको पूरक DNA संश्लेषण गर्न प्राइमरको 3′छेउमा DNA न्यूक्लियोटाइडहरू थप्छ।यस चरणको तापक्रम र अवधि प्राइमर, लक्षित आरएनए र प्रयोग गरिएको रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेजमा निर्भर गर्दछ।

अर्को, प्रारम्भिक विकृतीकरण चरण लागू हुन्छ, जसको परिणाम RNA-DNA हाइब्रिडको विकृतीकरण हुन्छ।यो चरण DNA पोलिमरेज सक्रिय गर्न आवश्यक छ।एकै समयमा, उल्टो ट्रान्सक्रिप्टेस निष्क्रिय छ।

PCR मा थर्मल चक्र को एक श्रृंखला समावेश छ।प्रत्येक चक्रमा विकृतिकरण, एनिलिङ र विस्तार चरणहरू हुन्छन्।

विकृतीकरण चरणमा प्रतिक्रिया कक्षलाई 95 डिग्री सेल्सियसमा तताउने र डबल-स्ट्र्यान्डेड डीएनए टेम्प्लेटको विकृतिकरणको लागि प्रयोग गर्ने समावेश छ।

अर्को चरणमा, प्रतिक्रियाको तापमान 58 डिग्री सेल्सियसमा घटाइन्छ, जसले अगाडि प्राइमरलाई यसको एकल-स्ट्र्यान्डेड DNA टेम्प्लेटको पूरक भागमा एनिल गर्न अनुमति दिन्छ।annealing तापमान सीधा लम्बाइ र प्राइमर को संरचना मा निर्भर गर्दछ।

विस्तार चरणमा, DNA पोलिमरेजले नयाँ DNA स्ट्र्यान्डलाई संश्लेषण गर्दछ जुन DNA टेम्प्लेट स्ट्र्यान्डको पूरक हो।प्रतिक्रिया मिश्रणबाट 5′ देखि 3′ दिशामा टेम्प्लेटमा नि: शुल्क केन्द्रक पूरक थपेर।यस चरणको तापक्रम प्रयोग गरिएको DNA पोलिमरेजमा निर्भर गर्दछ।

पहिलो चक्र पछि, एक डबल-स्ट्र्यान्ड डीएनए लक्ष्य प्राप्त हुन्छ।

त्यसपछि, दोस्रो चक्र प्रविष्ट गर्नुहोस्।डबल-स्ट्र्यान्डेड डीएनए दुई एकल-स्ट्र्यान्ड डीएनए अणुहरू उत्पादन गर्न विकृत गरिएको छ।

अर्को चरणमा, प्रतिक्रियाको तापक्रम घटाइन्छ, प्राइमरहरूलाई प्रत्येक एकल-स्ट्र्यान्डेड DNA टेम्प्लेटमा एनेल गरिएको छ, र Taq-man प्रोबलाई लक्षित DNA को पूरक भागमा एनेल गरिएको छ।

TaqMan प्रोबमा ओलिगोन्यूक्लियोटाइड प्रोबको 5′छेउसँग जोडिएको फ्लोरोफोर हुन्छ।जब साइकलको प्रकाश स्रोतबाट उत्साहित हुन्छ, फ्लोरोफोरले प्रतिदीप्ति उत्सर्जन गर्दछ।थप रूपमा, प्रोब 3′एंडमा क्वेन्चरबाट बनेको छ।क्वेन्चरसँग रिपोर्टर जीनको निकटताले फ्लोरोसेन्स पत्ता लगाउन रोक्छ।

विस्तार चरणमा, DNA पोलिमरेजले नयाँ स्ट्र्यान्डलाई संश्लेषण गर्दछ।जब पोलिमरेज TaqMan प्रोबमा पुग्छ, यसको अन्तर्जात 5′न्यूक्लिज गतिविधिले प्रोबलाई क्लीभ गर्छ, रङलाई क्वेन्चरबाट अलग गर्छ।

PCR को प्रत्येक चक्रको साथ, थप डाई अणुहरू रिलीज हुन्छन्, परिणामस्वरूप प्रतिदीप्ति तीव्रतामा संश्लेषित एम्प्लिकनहरूको संख्याको अनुपातमा वृद्धि हुन्छ।

यो विधिले नमूनामा अवस्थित दिइएको अनुक्रमको संख्या अनुमान गर्न अनुमति दिन्छ।प्रत्येक चक्रमा डबल-स्ट्र्यान्ड डीएनए टुक्राहरूको संख्या दोब्बर हुन्छ।तसर्थ, PCR धेरै सानो नमूनाहरू विश्लेषण गर्न प्रयोग गर्न सकिन्छ।

फ्लोरोसेन्ट सिग्नल, टंगस्टन हलोजन ल्याम्प, एक्साइटेशन फिल्टर, रिफ्लेक्टर, लेन्स, उत्सर्जन फिल्टर र चार्ज कपल्ड यन्त्र-प्रयोग CCD क्यामेरा मापन गर्न।

चरण 4 पत्ता लगाउनुहोस्

फ्लोरोसेन्ट सिग्नल, टंगस्टन हलोजन ल्याम्प, एक्साइटेशन फिल्टर, रिफ्लेक्टर, लेन्स, उत्सर्जन फिल्टर र चार्ज कपल्ड यन्त्र-प्रयोग CCD क्यामेरा मापन गर्न।

बत्तीबाट फिल्टर गरिएको प्रकाश रिफ्लेक्टरद्वारा प्रतिबिम्बित हुन्छ, कन्डेनसर लेन्सबाट जान्छ, र प्रत्येक प्वालको केन्द्रमा केन्द्रित हुन्छ।त्यसपछि प्वालबाट उत्सर्जित प्रतिदीप्ति ऐनाबाट प्रतिबिम्बित हुन्छ, उत्सर्जन फिल्टर मार्फत जान्छ, र CCD क्यामेरा द्वारा पत्ता लगाइन्छ।प्रत्येक पीसीआर चक्रमा, सेल्फ-उत्तेजित फ्लोरोफोर लाइट सीसीडीद्वारा पत्ता लगाउन सकिन्छ।

यसले क्याप्चर गरिएको प्रकाशलाई डिजिटल डाटामा रूपान्तरण गर्दछ।यो विधिलाई वास्तविक-समय PCR भनिन्छ, र यसले PCR प्रतिक्रियाको प्रगतिको वास्तविक-समय अनुगमन गर्न अनुमति दिन्छ।