PCR (पोलिमरेज चेन रियाक्सन) इन-भिट्रो डीएनए एम्प्लीफिकेशन टेक्नोलोजीहरू मध्ये एक हो, 30 वर्ष भन्दा बढीको इतिहास भएको।

पीसीआर प्रविधि सन् १९८३ मा सेटस, संयुक्त राज्य अमेरिकाका केरी मुलिसले सुरु गरेका थिए। मुलिसले सन् १९८५ मा पीसीआर पेटेन्टको लागि आवेदन दिए र त्यही वर्ष विज्ञानमा पहिलो पीसीआर शैक्षिक पेपर प्रकाशित गरे।मुलिसलाई उनको कामको लागि 1993 मा रसायनशास्त्रमा नोबेल पुरस्कार प्रदान गरिएको थियो।

PCR को आधारभूत सिद्धान्तहरू

PCR ले लक्षित DNA टुक्राहरूलाई एक मिलियन भन्दा बढी पटक विस्तार गर्न सक्छ।सिद्धान्त DNA पोलिमरेजको उत्प्रेरक अन्तर्गत छ, टेम्प्लेटको रूपमा अभिभावक स्ट्र्यान्ड DNA र विस्तारको लागि सुरूवात बिन्दुको रूपमा विशिष्ट प्राइमर प्रयोग गर्दै।यो विट्रोमा डेनेचुरेसन, एनेलिङ, र विस्तार जस्ता चरणहरू मार्फत प्रतिलिपि गरिएको छ।छोरी स्ट्र्यान्ड DNA को प्रक्रिया अभिभावक स्ट्र्यान्ड टेम्प्लेट DNA को पूरक हो।

मानक PCR प्रक्रियालाई तीन चरणहरूमा विभाजन गरिएको छ:

1. Denaturation: DNA डबल स्ट्र्यान्डहरू अलग गर्न उच्च तापक्रम प्रयोग गर्नुहोस्।DNA डबल स्ट्र्यान्डहरू बीचको हाइड्रोजन बन्ड उच्च तापमान (93-98 ℃) मा भाँचिएको छ।

2. एनेलिङ: डबल-स्ट्र्यान्डेड डीएनए अलग भएपछि, तापक्रम कम गर्नुहोस् ताकि प्राइमर एकल-स्ट्र्यान्डेड डीएनएमा बाँध्न सकोस्।

3. एक्स्टेन्सन: DNA पोलिमरेजले तापमान घटाउँदा प्राइमरहरूबाट DNA स्ट्र्यान्डहरूसँगै पूरक स्ट्र्यान्डहरू संश्लेषण गर्न थाल्छ।जब विस्तार पूरा हुन्छ, एक चक्र पूरा हुन्छ, र DNA टुक्राहरूको संख्या दोब्बर हुन्छ

यी तीन चरणहरू 25-35 पटक पारस्परिक रूपमा, DNA टुक्राहरूको संख्या द्रुत रूपमा बढ्नेछ।

PCR को सरलता यो हो कि विभिन्न प्राइमरहरू विभिन्न लक्षित जीनहरूका लागि डिजाइन गर्न सकिन्छ, ताकि लक्षित जीन टुक्राहरूलाई छोटो अवधिमा विस्तार गर्न सकिन्छ।

अहिलेसम्म पीसीआरलाई साधारण पीसीआर, फ्लोरोसेन्ट क्वान्टीटेटिभ पीसीआर र डिजिटल पीसीआर गरी तीन वर्गमा विभाजन गर्न सकिन्छ।

साधारण PCR को पहिलो पुस्ता

लक्ष्य जीन विस्तार गर्न एक साधारण PCR प्रवर्धन उपकरण प्रयोग गर्नुहोस्, र त्यसपछि उत्पादन पत्ता लगाउन agarose जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस प्रयोग गर्नुहोस्, केवल गुणात्मक विश्लेषण गर्न सकिन्छ।

पहिलो पुस्ता PCR को मुख्य हानि:

1. गैर-विशिष्ट प्रवर्धन र गलत सकारात्मक परिणामहरूको लागि प्रवण।

2. पत्ता लगाउन लामो समय लाग्छ र अपरेशन बोझिल छ।

3. मात्र गुणात्मक परीक्षण गर्न सकिन्छ

दोस्रो पुस्ताको वास्तविक समय पीसीआर

वास्तविक-समय PCR, qPCR को रूपमा पनि चिनिन्छ, फ्लोरोसेन्ट प्रोबहरू प्रयोग गर्दछ जसले प्रतिक्रिया प्रणालीको प्रगति संकेत गर्न सक्छ, र फ्लोरोसेन्ट संकेतहरूको संचय मार्फत एम्प्लीफाइड उत्पादनहरूको संचयलाई निगरानी गर्दछ, र प्रतिदीप्ति कर्भ मार्फत परिणामहरू न्याय गर्दछ।यसलाई Cq मान र मानक वक्रको मद्दतले परिमाण गर्न सकिन्छ।

किनभने qPCR प्रविधि बन्द प्रणालीमा गरिन्छ, प्रदूषणको सम्भावना कम हुन्छ, र फ्लोरोसेन्स संकेत मात्रात्मक पत्ता लगाउनको लागि निगरानी गर्न सकिन्छ, त्यसैले यो क्लिनिकल अभ्यासमा सबैभन्दा व्यापक रूपमा प्रयोग गरिन्छ र PCR मा प्रमुख प्रविधि भएको छ।

वास्तविक-समय फ्लोरोसेन्ट परिमाणात्मक PCR मा प्रयोग हुने फ्लोरोसेन्ट पदार्थहरूलाई विभाजन गर्न सकिन्छ: TaqMan फ्लोरोसेन्ट प्रोब, आणविक बीकन र फ्लोरोसेन्ट डाई।

1) TaqMan फ्लोरोसेन्ट प्रोब:

PCR एम्प्लीफिकेशनको क्रममा, प्राइमरको जोडी थप्दा एक विशिष्ट फ्लोरोसेन्ट प्रोब थपिन्छ।प्रोब एक ओलिगोन्यूक्लियोटाइड हो, र दुबै छेउमा रिपोर्टर फ्लोरोसेन्ट समूह र क्वेन्चर फ्लोरोसेन्ट समूहको साथ लेबल गरिएको छ।

जब प्रोब अक्षुण्ण हुन्छ, रिपोर्टर समूह द्वारा उत्सर्जित फ्लोरोसेन्ट संकेत शमन समूह द्वारा अवशोषित हुन्छ;PCR एम्प्लीफिकेशनको समयमा, Taq इन्जाइमको 5′-3′ exonuclease गतिविधिले जाँचलाई क्लीभ र घटाउँछ, जसले रिपोर्टर फ्लोरोसेन्ट समूह र क्वेन्चरलाई फ्लोरोसेन्ट समूहलाई अलग पार्छ, जसले गर्दा प्रतिदीप्ति अनुगमन प्रणालीले प्रतिदीप्ति सङ्केत प्राप्त गर्न सक्छ, अर्थात्, प्रत्येक पटक एम्प्लोरेसेन्ट र एम्प्लिफाईड हुन्छ। प्रतिदीप्ति संकेत को संचय PCR उत्पादन को गठन संग पूर्ण रूपमा सिंक्रोनाइज गरिएको छ।

२) SYBR फ्लोरोसेन्ट डाई:

PCR प्रतिक्रिया प्रणालीमा, SYBR फ्लोरोसेन्ट डाई थपिएको छ।SYBR फ्लोरोसेन्ट डाई गैर-विशेष रूपमा DNA डबल-स्ट्र्यान्डमा समावेश भएपछि, यसले फ्लोरोसेन्ट संकेत उत्सर्जन गर्दछ।चेनमा समाहित नभएको SYBR डाई अणुले कुनै पनि फ्लोरोसेन्ट सिग्नल उत्सर्जन गर्दैन, जसले गर्दा फ्लोरोसेन्ट सिग्नल सुनिश्चित हुन्छ। PCR उत्पादनहरूमा भएको वृद्धि PCR उत्पादनहरूमा भएको वृद्धिसँग पूर्ण रूपमा सिंक्रोनाइज हुन्छ।SYBR ले डबल-स्ट्र्यान्डेड DNA मा मात्र बाँध्छ, त्यसैले PCR प्रतिक्रिया विशिष्ट छ कि छैन भनेर पग्लन कर्भ प्रयोग गर्न सकिन्छ।

3) आणविक बीकन:

यो स्टेम-लूप डबल-लेबल गरिएको ओलिगोन्यूक्लियोटाइड प्रोब हो जसले 5 र 3 छेउमा लगभग 8 आधारहरूको हेयरपिन संरचना बनाउँछ।दुबै छेउमा न्यूक्लिक एसिड अनुक्रमहरू पूरक रूपमा जोडिएका छन्, जसले गर्दा फ्लोरोसेन्ट समूह र शमन समूह कडा हुन्छ।बन्द गर्नुहोस्, कुनै प्रतिदीप्ति उत्पादन गरिने छैन।

PCR उत्पादन उत्पन्न भएपछि, annealing प्रक्रियाको क्रममा, आणविक बीकनको बीचको भागलाई एक विशिष्ट DNA अनुक्रमसँग जोडिएको छ, र फ्लोरोसेन्ट जीनलाई क्वेन्चर जीनबाट फ्लोरोसेन्स उत्पादन गर्न अलग गरिन्छ।

दोस्रो पुस्ताको पीसीआरका मुख्य हानिहरू:

संवेदनशीलता अझै पनि अभाव छ, र कम-प्रतिलिपि नमूनाहरूको पहिचान गलत छ।

त्यहाँ पृष्ठभूमि मान को प्रभाव छ, र परिणाम हस्तक्षेप को लागी संवेदनशील छ।

जब प्रतिक्रिया प्रणालीमा PCR अवरोधकहरू हुन्छन्, पत्ता लगाउने परिणामहरू हस्तक्षेपको लागि संवेदनशील हुन्छन्।

तेस्रो पुस्ताको डिजिटल पीसीआर

डिजिटल PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) ले अन्तिम बिन्दु पत्ता लगाउने मार्फत लक्ष्य अनुक्रमको प्रतिलिपि संख्या गणना गर्दछ, र आन्तरिक नियन्त्रण र मानक कर्भहरू प्रयोग नगरी सही निरपेक्ष मात्रात्मक पत्ता लगाउन सक्छ।

डिजिटल PCR ले अन्त-बिन्दु पत्ता लगाउने प्रयोग गर्दछ र Ct मान (चक्र थ्रेसहोल्ड) मा निर्भर गर्दैन, त्यसैले डिजिटल PCR प्रतिक्रिया प्रवर्द्धन दक्षताबाट कम प्रभावित हुन्छ, र PCR प्रतिक्रिया अवरोधकहरूको सहिष्णुता उच्च सटीकता र पुन: उत्पादन क्षमताको साथ सुधारिएको छ।

उच्च संवेदनशीलता र उच्च शुद्धताको विशेषताहरूको कारण, यो PCR प्रतिक्रिया अवरोधकहरू द्वारा सजिलै हस्तक्षेप गर्दैन, र यसले मानक उत्पादनहरू बिना नै वास्तविक पूर्ण मात्रा प्राप्त गर्न सक्छ, जुन अनुसन्धान र अनुप्रयोग हटस्पट भएको छ।

प्रतिक्रिया एकाइ को विभिन्न रूपहरु को अनुसार, यो तीन मुख्य प्रकार मा विभाजित गर्न सकिन्छ: microfluidic, चिप र droplet प्रणाली।

१) माइक्रोफ्लुइडिक डिजिटल पीसीआर, एमडीपीसीआर:

माइक्रोफ्लुइडिक प्रविधिको आधारमा, डीएनए टेम्प्लेट अलग गरिएको छ।माइक्रोफ्लुइडिक टेक्नोलोजीले नमूना न्यानो-अपग्रेडिङ वा साना थोपाहरूको उत्पादनलाई महसुस गर्न सक्छ, तर थोपाहरूलाई विशेष शोषण विधि चाहिन्छ र त्यसपछि PCR प्रतिक्रिया प्रणालीसँग जोडिन्छ।mdPCR लाई बिस्तारै बिस्तारै अन्य विधि अपनाउन थालेको छ।

२) ड्रपलेटमा आधारित डिजिटल पीसीआर, डीडीपीसीआर:

नमूनालाई थोपाहरूमा प्रशोधन गर्न वाटर-इन-तेल ड्रपलेट उत्पादन प्रविधि प्रयोग गर्नुहोस्, र न्यूक्लिक एसिड अणुहरू भएको प्रतिक्रिया प्रणालीलाई हजारौं नानोस्केल थोपाहरूमा विभाजन गर्नुहोस्, जसमध्ये प्रत्येकले पत्ता लगाउन न्युक्लिक एसिड लक्ष्य अणु समावेश गर्दैन, वा परीक्षण गर्न एक देखि धेरै न्यूक्लिक एसिड लक्ष्य अणुहरू समावेश गर्दछ।

३) चिपमा आधारित डिजिटल पीसीआर, सीडीपीसीआर:

सिलिकन वेफर्स वा क्वार्ट्ज गिलासमा धेरै माइक्रोट्यूबहरू र माइक्रोकाभिटीहरू खोप्न एकीकृत फ्लुइड पाथवे टेक्नोलोजी प्रयोग गर्नुहोस्, र विभिन्न नियन्त्रण भल्भहरू मार्फत समाधानको प्रवाहलाई नियन्त्रण गर्नुहोस्, र पूर्ण मात्रा प्राप्त गर्न डिजिटल PCR प्रतिक्रियाको लागि प्रतिक्रिया कुवाहरूमा नमूना तरल पदार्थलाई समान आकारको न्यानोमिटरहरूमा विभाजन गर्नुहोस्।

तेस्रो पुस्ता PCR को मुख्य हानि:

उपकरण र अभिकर्मक महँगो छन्।

टेम्प्लेट गुणस्तर आवश्यकताहरू उच्च छन्।यदि टेम्प्लेट मात्रा माइक्रोसिस्टम मात्रा भन्दा बढि छ भने, यो मापन गर्न असम्भव हुनेछ, र यदि यो धेरै सानो छ भने, परिमाणको शुद्धता कम हुनेछ।

गैर-विशिष्ट प्रवर्धन हुँदा गलत सकारात्मकहरू पनि उत्पन्न गर्न सकिन्छ।