PCR सबैभन्दा व्यापक रूपमा प्रयोग हुने न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन प्रविधि हो र यसको संवेदनशीलता र विशिष्टताको कारणले व्यापक रूपमा प्रयोग गरिन्छ।यद्यपि, PCR लाई बारम्बार थर्मल डिनेच्युरेसन चाहिन्छ र उपकरण र उपकरणहरूमा निर्भर हुने सीमितताहरूबाट छुटकारा पाउन सक्दैन, जसले क्लिनिकल क्षेत्र परीक्षणमा यसको प्रयोगलाई सीमित गर्दछ।

प्रारम्भिक 1990s देखि, धेरै प्रयोगशालाहरूले स्थिर तापक्रम प्रवर्धन प्रविधि विकास गर्न थालेका छन् जसलाई थर्मल डिनेचुरेसनको आवश्यकता पर्दैन।अब तिनीहरूले लूप-मध्यस्थता आइसोथर्मल एम्प्लिफिकेशन टेक्नोलोजी, स्ट्र्यान्ड रिप्लेसमेन्ट आइसोथर्मल एम्प्लिफिकेशन टेक्नोलोजी, रोलिङ सर्कल आइसोथर्मल एम्प्लिफिकेशन टेक्नोलोजी, र न्यूक्लिक एसिड अनुक्रम निर्भरता विकास गरेका छन्।Isothermal प्रवर्धन प्रविधि र अन्य प्रविधिहरू। 

Lओओप-मध्यस्थ समतापीय प्रवर्धन

प्रवर्धन सिद्धान्त यस तथ्यमा आधारित छ कि DNA लगभग 65 डिग्री सेल्सियसमा गतिशील सन्तुलन अवस्थामा छ।जब कुनै पनि प्राइमर बेस-पेयर हुन्छ र डबल-स्ट्र्यान्ड डीएनएको पूरक भागमा विस्तार हुन्छ, अर्को स्ट्र्यान्ड अलग हुन्छ र एकल-स्ट्र्यान्ड हुन्छ।

यस तापक्रममा, DNA ले स्ट्र्यान्ड-डिस्प्लेसमेन्ट DNA पोलिमरेजमा भर पर्नको लागि 4 विशिष्ट प्राइमरहरू प्रयोग गर्दछ जसले स्ट्र्यान्ड-डिस्प्लेसमेन्ट DNA को संश्लेषणलाई निरन्तर रूपमा आत्म-संचालन गर्छ।

पहिले लक्षित जीनमा 6 विशिष्ट क्षेत्रहरू F3, F2, F1, B1, B2, B3 निर्धारण गर्नुहोस्, र त्यसपछि यी 6 विशिष्ट क्षेत्रहरूमा आधारित 4 प्राइमरहरू डिजाइन गर्नुहोस् (तलको चित्रमा देखाइएको छ):

अगाडिको भित्री प्राइमर (FIP) F1c र F2 मिलेर बनेको हुन्छ।

ब्याकवर्ड इनर प्राइमर (BIP) B1c र B2 मिलेर बनेको छ, र TTTT बीचमा स्पेसरको रूपमा प्रयोग गरिन्छ।

बाहिरी प्राइमरहरू F3 र B3 क्रमशः लक्षित जीनमा F3 र B3 क्षेत्रहरू मिलेर बनेका छन्।

LAMP प्रतिक्रिया प्रणालीमा, भित्री प्राइमरको एकाग्रता बाहिरी प्राइमरको भन्दा धेरै गुणा हुन्छ।भित्री प्राइमरलाई पहिले टेम्प्लेट स्ट्र्यान्डसँग जोडिएको हुन्छ जसलाई डिएनए डबल स्ट्र्यान्ड बनाउनको लागि पूरक स्ट्र्यान्डलाई संश्लेषित गरिन्छ।पछि, बाहिरी प्राइमरलाई टेम्प्लेट स्ट्र्यान्डसँग मिलाएर DNA डबल स्ट्र्यान्ड बनाइन्छ।BstDNA पोलिमरेजको कार्य अन्तर्गत, भित्री प्राइमर द्वारा संश्लेषित पूरक स्ट्र्यान्ड रिलीज हुन्छ।प्रतिक्रियाहरूको श्रृंखला पछि, पूरक स्ट्र्यान्डले अन्ततः डम्बेल संरचनाको साथ एकल DNA स्ट्र्यान्ड बनाउँछ।

डम्बेल संरचना DNA एकल स्ट्र्यान्ड आफैंलाई टेम्प्लेटको रूपमा प्रयोग गरिन्छ जुन खुला छेउको साथ एक संक्रमणकालीन स्टेम-लूप संरचना DNA बनाउँदछ।भित्री र बाहिरी प्राइमरहरूले संक्रमणकालीन स्टेम-लूप संरचना DNA लाई निरन्तर स्ट्र्यान्ड विस्थापन र विस्तार प्रतिक्रियाहरू गुजर्नको लागि मार्गदर्शन गर्दछ, र अन्तमा विभिन्न लम्बाइका साथ धेरै स्टेम-लूप संरचनाहरू बनाउँदछ।डीएनए मिश्रण।

लुप-मध्यस्थता आइसोथर्मल एम्प्लिफिकेशनका फाइदाहरू र हानिहरू

LAMP का फाइदाहरू:

(1) उच्च प्रवर्द्धन दक्षता, जसले प्रभावकारी रूपमा लक्षित जीनको 1-10 प्रतिहरू 1 घण्टा भित्र विस्तार गर्न सक्छ, र प्रवर्द्धन दक्षता साधारण PCR भन्दा 10-100 गुणा हुन्छ।

(2) प्रतिक्रिया समय छोटो छ, विशिष्टता बलियो छ, र कुनै विशेष उपकरण आवश्यक छैन।

LAMP का कमजोरीहरू:

(1) प्राइमरहरूको लागि आवश्यकताहरू विशेष गरी उच्च छन्।

(२) प्रवर्धित उत्पादन क्लोनिङ र अनुक्रमको लागि प्रयोग गर्न सकिँदैन, तर निर्णयको लागि मात्र प्रयोग गर्न सकिन्छ।

(3) यसको बलियो संवेदनशीलताको कारण, यो एरोसोलहरू बनाउन सजिलो छ, गलत सकारात्मक निम्त्याउँछ र परीक्षण परिणामहरूलाई असर गर्छ।

Sट्र्यान्ड विस्थापन प्रवर्धन

स्ट्र्यान्ड डिस्प्लेसमेन्ट एम्प्लिफिकेशन (SDA) एक इन भिट्रो आइसोथर्मल DNA एम्प्लिफिकेशन प्रविधि हो जुन पहिलो पटक अमेरिकी विद्वान वाकरले 1992 मा प्रस्ताव गरेको इन्जाइम्याटिक प्रतिक्रियामा आधारित छ।

SDA को आधारभूत प्रणालीमा एक प्रतिबन्ध endonuclease, एक DNA पोलिमरेज स्ट्र्यान्ड विस्थापन गतिविधि, दुई जोडी प्राइमरहरू, dNTPs, र क्याल्सियम र म्याग्नेसियम आयनहरू र बफर प्रणालीहरू समावेश छन्।

स्ट्र्यान्ड विस्थापन प्रवर्धनको सिद्धान्त लक्ष्य DNA को दुबै छेउमा रासायनिक परिमार्जित प्रतिबन्ध endonuclease मान्यता अनुक्रम मा आधारित छ।एन्डोन्यूक्लिजले यसको पहिचान साइटमा स्ट्र्यान्ड डीएनएमा ग्याप खोल्छ, र डीएनए पोलिमरेजले ग्याप 3′ अन्त्य विस्तार गर्दछ र अर्को डीएनए स्ट्र्यान्डलाई प्रतिस्थापन गर्दछ।

DNA को प्रतिस्थापित एकल स्ट्र्यान्डहरू प्राइमरहरूसँग जोड्न सकिन्छ र DNA पोलिमरेजद्वारा डबल स्ट्र्यान्डहरूमा विस्तार गर्न सकिन्छ।यो प्रक्रिया लगातार दोहोर्याइएको छ, ताकि लक्ष्य अनुक्रम कुशलतापूर्वक विस्तार गरिएको छ।

स्ट्र्यान्ड विस्थापन एम्प्लीफिकेशन टेक्नोलोजीका फाइदाहरू र हानिहरू

SDA को फाइदाहरू:

प्रवर्धन दक्षता उच्च छ, प्रतिक्रिया समय छोटो छ, विशिष्टता बलियो छ, र कुनै विशेष उपकरण आवश्यक छैन।

SDA का कमजोरीहरू:

उत्पादनहरू एकसमान हुँदैनन्, र केही एकल-स्ट्र्यान्डेड र डबल-स्ट्र्यान्डेड उत्पादनहरू सधैं SDA चक्रमा उत्पादन हुन्छन्, र इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा पत्ता लगाउँदा टेलिंग अनिवार्य रूपमा देखा पर्नेछ।

Rओलिङ्ग सर्कल प्रवर्धन

रोलिङ सर्कल एम्प्लीफिकेशन (RCA) लाई रोलिङ सर्कलद्वारा रोगजनक जीवहरूबाट DNA प्रतिलिपि गर्ने तरिकामा चित्रण गरेर प्रस्ताव गरिएको छ।यसले एकल-स्ट्र्यान्डेड गोलाकार DNA को स्थिर तापक्रममा टेम्प्लेटको रूपमा प्रयोग गर्ने, र लक्षित जीनको प्रवर्धन प्राप्त गर्न रोलिङ सर्कल DNA संश्लेषणको कार्य अन्तर्गत एक विशेष DNA पोलिमरेज (जस्तै Phi29) लाई जनाउँछ।

RCA लाई रैखिक प्रवर्धन र घातीय प्रवर्धनमा विभाजन गर्न सकिन्छ।रैखिक RCA को दक्षता 10 पुग्न सक्छ⁵पटक, र घातीय RCA को दक्षता 10 पुग्न सक्छ⁹पटक।

सरल भिन्नता, तलको चित्रमा देखाइए अनुसार, रेखीय प्रवर्धन a ले 1 प्राइमर मात्र प्रयोग गर्दछ, घातीय प्रवर्धन b मा 2 प्राइमरहरू छन्।

Linear RCA लाई सिंगल प्राइमर RCA पनि भनिन्छ।एक प्राइमर गोलाकार DNA मा बाँध्छ र DNA पोलिमरेज को कार्य द्वारा विस्तारित हुन्छ।उत्पादन एक लूपको लम्बाइको हजारौं गुणा दोहोरिने अनुक्रमहरूको ठूलो संख्याको साथ एक रैखिक एकल स्ट्र्यान्ड हो।

रैखिक RCA को उत्पादन जहिले पनि प्रारम्भिक प्राइमरमा जडान भएको हुनाले, सिग्नलको सजिलो फिक्सेशन एक प्रमुख फाइदा हो।

एक्सपोनेन्शियल आरसीए, हाइपर ब्रांच्ड एम्प्लीफिकेशन एचआरसीए (हाइपर ब्रान्च्ड आरसीए) को रूपमा पनि चिनिन्छ, एक्सपोनेन्शियल आरसीएमा, एउटा प्राइमरले आरसीए उत्पादनलाई बढाउँछ, दोस्रो प्राइमरले आरसीए उत्पादनसँग हाइब्रिडाइज गर्छ र विस्तार गर्दछ, र प्रतिस्थापन पहिले नै RCA उत्पादनमा बाँधिएको छ, डाउनस्ट्रीम प्राइमरहरूले स्ट्र्यान्ड विस्तार गर्दछ, र एक्सटेन्सन उत्पादन एएमपीएलआरसीए पुन: उत्पादन गर्न।

रोलिङ सर्कल न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धनको फाइदा र बेफाइदाहरू

RCA को फाइदाहरू:

उच्च संवेदनशीलता, राम्रो विशिष्टता र सजिलो सञ्चालन।

RCA का कमजोरीहरू:

संकेत पत्ता लगाउने क्रममा पृष्ठभूमि समस्याहरू।RCA प्रतिक्रिया को समयमा, uncirculated padlock प्रोब र टेम्प्लेट DNA वा अनबाउन्ड प्रोब को RNA ले केहि पृष्ठभूमि संकेतहरू उत्पन्न गर्न सक्छ। 

Nucleicacid अनुक्रम आधारित प्रवर्धन

न्यूक्लिक एसिड सिक्वेन्स-बेस्ड एम्प्लिफिकेशन (NASBA) PCR को आधारमा विकसित गरिएको नयाँ प्रविधि हो।यो एक T7 प्रमोटर अनुक्रम संग प्राइमर को एक जोडी द्वारा निर्देशित एक निरन्तर र आइसोथर्मल न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन हो।टेक्नोलोजीले टेम्प्लेट आरएनएलाई करिब २ घण्टामा करिब १०९ पटक विस्तार गर्न सक्छ, जुन परम्परागत पीसीआर विधिभन्दा १००० गुणा बढी हो र विशेष उपकरणको आवश्यकता पर्दैन।

यो प्रविधि देखा पर्ने बित्तिकै रोगहरूको द्रुत निदानको लागि प्रयोग गरिएको छ, र हाल धेरै कम्पनीहरूले यो विधि आरएनए पत्ता लगाउने किटहरूमा प्रयोग गर्छन्।

यद्यपि RNA एम्प्लीफिकेशनले रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन PCR प्रविधि पनि प्रयोग गर्न सक्छ, NASBA का आफ्नै फाइदाहरू छन्: यो अपेक्षाकृत स्थिर तापक्रम अवस्थाहरूमा गर्न सकिन्छ, र यो परम्परागत PCR प्रविधि भन्दा बढी स्थिर र सही छ।

प्रतिक्रिया ४१ डिग्री सेल्सियसमा हुन्छ र पूरा गर्नका लागि AMV (एभियन माइलोब्लास्टोसिस भाइरस) रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेज, RNase H, T7 RNA पोलिमरेज र एक जोडी प्राइमर चाहिन्छ।

प्रक्रिया मुख्य रूपमा समावेश:

अगाडिको प्राइमरले T7 प्रमोटरको पूरक अनुक्रम समावेश गर्दछ।प्रतिक्रियाको समयमा, अगाडिको प्राइमर आरएनए स्ट्र्यान्डमा बाँध्छ र AMV इन्जाइमद्वारा DNA-RNA डबल स्ट्र्यान्ड बनाउन उत्प्रेरित हुन्छ।

RNase H ले हाइब्रिड डबल-स्ट्र्यान्डमा RNA पचाउँछ र एकल-स्ट्र्यान्ड DNA राख्छ।

रिभर्स प्राइमर र AMV इन्जाइमको कार्य अन्तर्गत, T7 प्रमोटर अनुक्रम भएको DNA डबल स्ट्र्यान्ड बनाइन्छ।

T7 RNA पोलिमरेजको कार्य अन्तर्गत, ट्रान्सक्रिप्शन प्रक्रिया पूरा हुन्छ र लक्ष्य आरएनएको ठूलो मात्रा उत्पादन हुन्छ।

NASBA का फाइदाहरू:

(1) यसको प्राइमरमा T7 प्रमोटर अनुक्रम छ, तर विदेशी डबल-स्ट्र्यान्डेड DNA मा T7 प्रमोटर अनुक्रम छैन र विस्तार गर्न सकिँदैन, त्यसैले यो प्रविधि उच्च विशिष्टता र संवेदनशीलता छ।

(२) NASBA ले रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन प्रक्रियालाई प्रवर्धन प्रतिक्रियामा प्रत्यक्ष रूपमा समावेश गर्दछ, प्रतिक्रिया समय छोटो पार्छ।

NASBA का बेफाइदाहरू:

(1) प्रतिक्रिया घटकहरू अधिक जटिल छन्।

(2) प्रतिक्रिया लागत उच्च बनाउन तीन प्रकारका इन्जाइमहरू आवश्यक पर्दछ।