Ct मान फ्लोरोसेन्ट परिमाणात्मक PCR को सबैभन्दा महत्त्वपूर्ण परिणाम प्रस्तुतीकरण रूप हो।यो जीन अभिव्यक्ति भिन्नता वा जीन प्रतिलिपि संख्या गणना गर्न प्रयोग गरिन्छ।त्यसोभए फ्लोरोसेन्स क्वान्टिफिकेशनको Ct मानलाई के उचित मानिन्छ?Ct मानको प्रभावकारी दायरा कसरी सुनिश्चित गर्ने?
Ct मान के हो?
qPCR एम्प्लीफिकेशन प्रक्रियाको बखत, एम्प्लीफाइड उत्पादनको फ्लोरोसेन्स सिग्नल सेट फ्लोरोसेन्स थ्रेसहोल्डमा पुग्दा एम्प्लीफिकेशन चक्र (साइकल थ्रेसहोल्ड) को सम्बन्धित संख्या।C को अर्थ साइकल र T को अर्थ थ्रेसहोल्ड हो।सरल भाषामा भन्नुपर्दा, Ct मान भनेको qPCR मा प्रारम्भिक टेम्प्लेट एम्प्लिफिकेशन उत्पादनको निश्चित मात्रामा पुग्दा सम्बन्धित चक्रहरूको संख्या हो।तथाकथित "उत्पादन को एक निश्चित मात्रा" पछि थप व्याख्या गरिनेछ।
Ct मानले के गर्छ?
1. घातीय प्रवर्धन, टेम्प्लेट रकम र Ct मान बीचको सम्बन्ध
आदर्श रूपमा, qPCR मा जीनहरू निश्चित संख्याको चक्र पछि घातीय प्रवर्धन द्वारा संचित हुन्छन्।प्रवर्द्धन चक्रको संख्या र उत्पादनहरूको मात्रा बीचको सम्बन्ध हो: एम्प्लीफाइड उत्पादन रकम = प्रारम्भिक टेम्प्लेट रकम × (1+En) चक्र संख्या।यद्यपि, qPCR प्रतिक्रिया सधैं एक आदर्श स्थिति मा छैन।जब एम्प्लीफाइड उत्पादनको मात्रा "निश्चित उत्पादन रकम" मा पुग्छ, यस समयमा चक्रहरूको संख्या Ct मान हो, र यो घातीय प्रवर्धन अवधिमा हुन्छ।Ct मान र प्रारम्भिक टेम्प्लेटको मात्रा बीचको सम्बन्ध: टेम्प्लेटको Ct मान र टेम्प्लेटको प्रारम्भिक प्रतिलिपि नम्बरको लगरिथम बीचको एक रेखीय सम्बन्ध छ।प्रारम्भिक टेम्प्लेट एकाग्रता जति उच्च हुन्छ, Ct मान उति सानो हुन्छ;प्रारम्भिक टेम्प्लेट एकाग्रता जति कम हुन्छ, Ct मान उति ठूलो हुन्छ।
2. प्रवर्धन कर्भ, प्रतिदीप्ति थ्रेसहोल्ड र निश्चित PCR उत्पादन रकम
qPCR प्रवर्धन उत्पादन को मात्रा सीधा फ्लोरोसेंट संकेत को रूप मा प्रस्तुत गरिएको छ, त्यो हो, प्रवर्धन वक्र।PCR को प्रारम्भिक चरणमा, एम्प्लीफिकेशन आदर्श अवस्थामा छ, चक्रहरूको संख्या सानो छ, उत्पादन संचय सानो छ, र फ्लोरोसेन्सको स्तर फ्लोरोसेन्स पृष्ठभूमिबाट स्पष्ट रूपमा छुट्याउन सकिँदैन।त्यस पछि, प्रतिदीप्ति बढ्छ र घातीय चरणमा प्रवेश गर्दछ।PCR उत्पादनको मात्रा एक निश्चित बिन्दुमा पत्ता लगाउन सकिन्छ जब PCR प्रतिक्रिया घातांक चरणमा हुन्छ, जसलाई "उत्पादनको निश्चित मात्रा" को रूपमा प्रयोग गर्न सकिन्छ, र टेम्प्लेटको प्रारम्भिक सामग्री यसबाट अनुमान गर्न सकिन्छ।तसर्थ, उत्पादन को एक निश्चित मात्रा संगत प्रतिदीप्ति संकेत तीव्रता प्रतिदीप्ति थ्रेसहोल्ड हो।
PCR को अन्तिम चरणमा, एम्प्लीफिकेशन कर्भले घातीय प्रवर्धन देखाउँदैन, र रेखीय चरण र पठार चरणमा प्रवेश गर्दछ।
3. Ct मानहरूको पुन: उत्पादन क्षमता
जब PCR चक्र Ct मानको चक्र नम्बरमा पुग्छ, यो भर्खरै वास्तविक घातीय प्रवर्धन अवधिमा प्रवेश गरेको छ।यस समयमा, सानो त्रुटि एम्प्लीफाइड गरिएको छैन, त्यसैले Ct मानको पुनरुत्पादन उत्कृष्ट छ, त्यो हो, एउटै टेम्प्लेट विभिन्न समयमा वा एकै समयमा विभिन्न ट्यूबहरूमा विस्तार गरिएको छ।प्रवर्धन, प्राप्त Ct मान स्थिर छ।
1. प्रवर्धन दक्षता ई
PCR एम्प्लिफिकेशन दक्षता भनेको दक्षतालाई जनाउँछ जसको साथ पोलिमरेजले जीनलाई एम्प्लिकोनमा परिवर्द्धन गर्दछ।एउटा DNA अणु दुई DNA अणुमा परिणत हुँदा प्रवर्धन दक्षता १००% हुन्छ।प्रवर्धन दक्षता सामान्यतया En को रूपमा व्यक्त गरिन्छ।पछिल्ला लेखहरूको विश्लेषणलाई सहज बनाउनको लागि, प्रवर्धन दक्षतालाई असर गर्ने कारकहरूलाई संक्षिप्त रूपमा प्रस्तुत गरिएको छ।
| प्रभावकारी कारकहरू | व्याख्या | कसरी न्याय गर्ने? |
| A. PCR अवरोधकहरू | 1. टेम्प्लेट DNA ले PCR प्रतिक्रियालाई रोक्ने पदार्थहरू समावेश गर्दछ, जस्तै प्रोटीन वा डिटर्जेन्टहरू।2. रिभर्स ट्रान्सक्रिप्सन पछिको cDNA मा टेम्प्लेट RNA वा RT अभिकर्मक घटकहरूको उच्च एकाग्रता हुन्छ, जसले पछिको PCR प्रतिक्रियालाई पनि रोक्न सक्छ। | 1. प्रदूषण छ कि छैन भनेर A260/A280 र A260/A230 वा RNA इलेक्ट्रोफोरेसिस को अनुपात मापन गर्न सकिन्छ।2. रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन पछि सीडीएनए निश्चित अनुपात अनुसार पातलो छ कि छैन। |
| B. अनुचित प्राइमर डिजाइन | प्राइमरहरू कुशलतापूर्वक एनिल गर्दैनन् | प्राइमर-डाइमर वा हेयरपिन, बेमेल, र कहिलेकाहीँ अन्तर्निहित डिजाइनहरू फैलिएको प्राइमरहरू जाँच गर्नुहोस्। |
| C. अनुचित PCR प्रतिक्रिया कार्यक्रम डिजाइन | 1. प्राइमरहरूले प्रभावकारी रूपमा एनिल गर्न सक्दैनन्2. DNA पोलिमरेजको अपर्याप्त रिलीज 3. दीर्घकालीन उच्च तापमान DNA पोलिमरेज गतिविधि घट्यो | 1. annealing तापमान प्राइमर को TM मान भन्दा उच्च छ2. प्रि-डिनेच्युरेसन समय धेरै छोटो छ 3. प्रतिक्रिया प्रक्रिया को प्रत्येक चरण को समय धेरै लामो छ |
| D. अभिकर्मक वा पाइपिङ त्रुटिहरूको अपर्याप्त मिश्रण | प्रतिक्रिया प्रणालीमा, PCR प्रतिक्रिया घटकहरूको स्थानीय एकाग्रता धेरै उच्च वा असमान हुन्छ, परिणामस्वरूप PCR प्रवर्धनको गैर-घातीय प्रवर्धन हुन्छ। | |
| E. एम्प्लिकन लम्बाइ | एम्प्लिकनको लम्बाइ धेरै लामो छ, 300bp भन्दा बढि छ, र एम्प्लीफिकेशन दक्षता कम छ | एम्प्लिकन लम्बाइ 80-300bp को बीचमा छ भनेर जाँच गर्नुहोस् |
| F. qPCR अभिकर्मकहरूको प्रभाव | अभिकर्मकमा DNA पोलिमरेजको एकाग्रता कम छ वा बफरमा आयनहरूको एकाग्रता अनुकूलित छैन, परिणामस्वरूप Taq इन्जाइम गतिविधि अधिकतममा पुग्न सक्दैन। | मानक वक्र द्वारा प्रवर्धन दक्षता को निर्धारण |
2. Ct मानहरूको दायरा
Ct मानहरू 15-35 सम्मका हुन्छन्।यदि Ct मान 15 भन्दा कम छ भने, यो प्रवर्द्धन आधारभूत अवधिको दायरा भित्र छ र फ्लोरोसेन्स थ्रेसहोल्डमा पुगेको छैन भन्ने मानिन्छ।आदर्श रूपमा, त्यहाँ Ct मान र टेम्प्लेटको प्रारम्भिक प्रतिलिपि नम्बरको लोगारिदम बीचको एक रेखीय सम्बन्ध छ, त्यो हो, मानक वक्र।मानक वक्र मार्फत, जब एम्प्लीफिकेशन दक्षता १००% हुन्छ, जीनको एकल प्रतिलिपि नम्बरको परिमाणको लागि गणना गरिएको Ct मान लगभग 35 हुन्छ। यदि यो 35 भन्दा ठूलो छ भने, टेम्प्लेटको प्रारम्भिक प्रतिलिपि संख्या सैद्धान्तिक रूपमा 1 भन्दा कम हुन्छ, जुन अर्थहीन मान्न सकिन्छ।
विभिन्न जीन Ct दायराहरूको लागि, प्रारम्भिक टेम्प्लेट रकममा जीन प्रतिलिपि संख्या र एम्प्लीफिकेशन दक्षतामा भिन्नताको कारण, यो जीनको लागि मानक वक्र बनाउन र जीनको रेखीय पत्ता लगाउने दायरा गणना गर्न आवश्यक छ।
3. Ct मानको प्रभावकारी कारकहरू
प्रवर्धन चक्रको संख्या र उत्पादनको मात्रा बीचको सम्बन्धबाट: एम्प्लीफाइड उत्पादनको मात्रा = प्रारम्भिक टेम्प्लेटको मात्रा × (1+En) चक्र नम्बर, यो देख्न सकिन्छ कि आदर्श अवस्थाहरूमा, प्रारम्भिक टेम्प्लेट र En को मात्राले Ct मानमा नकारात्मक प्रभाव पार्छ।टेम्प्लेट गुणस्तर वा एम्प्लीफिकेशन दक्षतामा भिन्नताले Ct मान धेरै ठूलो वा धेरै सानो हुन सक्छ।
4.Ct मान धेरै ठूलो वा धेरै सानो छ
पोस्ट समय: फेब्रुअरी-22-2023
