प्रत्यक्ष PCR एक प्रतिक्रिया हो जसले प्रत्यक्ष रूपमा जनावर वा बोटको तन्तुलाई न्यूक्लिक एसिड निकासी बिना प्रवर्धनको लागि प्रयोग गर्दछ।धेरै तरिकामा, प्रत्यक्ष PCR ले नियमित PCR जस्तै काम गर्दछ

मुख्य भिन्नता प्रत्यक्ष PCR मा प्रयोग गरिएको कस्टम बफर हो, नमूनालाई न्यूक्लिक एसिड निकासी बिना नै PCR प्रतिक्रियाको अधीनमा हुन सक्छ, तर त्यहाँ इन्जाइमहरूको सहिष्णुता र प्रत्यक्ष PCR प्रतिक्रियामा संलग्न बफरको अनुकूलताका लागि सम्बन्धित आवश्यकताहरू छन्।

यद्यपि त्यहाँ सामान्य नमूनाहरूमा कम वा कम PCR अवरोधकहरू छन्, प्रत्यक्ष PCR ले अझै पनि इन्जाइमहरू र बफरहरूको कार्य अन्तर्गत विश्वसनीय प्रवर्धन प्राप्त गर्न सक्छ।परम्परागत PCR प्रतिक्रियालाई टेम्प्लेटको रूपमा उच्च-गुणस्तरको न्यूक्लिक एसिड चाहिन्छ, यदि टेम्प्लेटमा प्रोटीन र अन्य अशुद्धताहरू छन् भने PCR प्रतिक्रियाको सहज प्रगतिलाई रोक्न सक्छ।प्रत्यक्ष PCR हाल आणविक निदानको क्षेत्रमा सबैभन्दा लोकप्रिय प्रविधिहरू मध्ये एक हो।

०१ प्रत्यक्ष पीसीआर सुरुमा जनावर र बोटबिरुवाको लागि प्रयोग गरिएको थियो

प्रत्यक्ष PCR को प्रारम्भिक प्रयोग जनावर र बोटबिरुवाको क्षेत्रमा हो, जस्तै मुसाको रगत, तन्तु र केश, बिरालो, कुखुरा, खरायो, भेडा, गाईवस्तु इत्यादि, बिरुवाको पात र बीउ आदि, जीनोटाइपिङ, ट्रान्सजेनिक, प्लाज्मिड पत्ता लगाउने, जीन नकआउट स्रोत विश्लेषण, एसएनए पहिचान, स्पेसिफिकेशन एनालिसिस, एसएनए फिल्ड र अन्य। s

यी क्षेत्रहरूमा केही सामान्य विशेषताहरू छन्, त्यो हो, लक्षित जीन सामग्री अपेक्षाकृत उच्च छ र न्यूक्लिक एसिड निकासी समस्याग्रस्त छ, त्यसैले प्रत्यक्ष PCR ले समय बचत गर्न र परिणामहरूमा सानो प्रभाव मात्र होइन, तर लागत पनि बचत गर्न सक्छ।

रोगजनक पत्ता लगाउन प्रयोग गरिने प्रत्यक्ष PCR हालैका वर्षहरूको कुरा हो, केही PCR अभिकर्मक निर्माताहरूले यस दिशामा धेरै प्रयासहरू गरेका छन् जब नवाचार बनाउँछन्।विशेष गरी यस COVID-19 महामारीमा, यस्ता धेरै पत्ता लगाउने उत्पादनहरू बजारमा देखा परेका छन्, जस्तै SARS-CoV-2 न्यूक्लिक एसिड पत्ता लगाउने किट (मल्टीप्लेक्स पीसीआर फ्लोरोसेन्ट प्रोब मेथड) फोरजीनले अनुसन्धान र विकास गरेको छ, जसले मानवीय एसिड पत्ता लगाउन रियल-टाइम RT PCR टेक्नोलोजी (rRT-PCR) को गुणात्मक एसिड पत्ता लगाउन प्रयोग गर्दछ। oropharyngeal स्वाब नमूनाहरू।

Foregene सामान्य ORF1ab, N, E, र पत्ता लगाउनको लागि प्रत्यक्ष PCR प्रविधि प्रयोग गर्ने कम्पनीहरू मध्ये एक हो।संस्करण SARS-CoV-2 B.1.1.7 वंश (युके), B.1.351 वंश (ZA), B.1.617 वंश (IND) र P.1 वंश (BR) जस्ता मानव नासोफरिन्जियल वा ओरोफरिन्जियल स्वाब नमूनाहरूमा न्यूक्लिक एसिडहरू।

02  प्रत्यक्ष PCR को लागि अभिकर्मक आवश्यक छ

नमूना Lysate

नमूना lysate आफैले कन्फिगर गर्न वा खरिद गर्न सकिन्छ।lysate को विभिन्न ब्रान्ड को संरचना मा भिन्नता lysing क्षमता फरक हुनेछ, र त्यसपछि lysing समय अलि फरक हुनेछ।उदाहरणका लागि, जनावरको तन्तुका नमूनाहरूको तयारीको लागि, सामान्यतया 30 मिनेट वा रातभरको लिसिस सिफारिस गरिन्छ, र भाइरसहरूको लागि लिसिस समाधान 3-10 मिनेटको दायरामा हुन्छ।

पीसीआर मास्टर मिक्स

विशिष्ट प्रवर्द्धन बढाउन र प्रवर्द्धन क्षमता बढाउन हट-स्टार्ट डीएनए पोलिमरेज प्रयोग गर्न सिफारिस गरिन्छ।प्रत्यक्ष PCR को कोर एक उच्च सहनशील पोलिमरेज हो।

डीएनए प्रवर्धनलाई असर गर्ने नमूनामा भएका कम्पोनेन्टहरू हटाउनुहोस् वा रोक्नुहोस्

नमूनालाई लाइसेटसँग प्रशोधन गरिसकेपछि, प्रोटिन, लिपिड र अन्य सेल मलबेहरू रिलिज हुनेछन्, यी पदार्थहरूले PCR प्रतिक्रियालाई रोक्नेछ।तसर्थ, प्रत्यक्ष PCR लाई यी कारकहरूको प्रभाव कम गर्न सम्बन्धित हटाउने वा अवरोधकहरू थप्न आवश्यक छ।

03  प्रत्यक्ष PCR को पाँच ज्ञान बिन्दुहरूको संग्रह

पहिलो, प्रत्यक्ष पीसीआर प्रविधि विभिन्न जैविक नमूनाहरूको लागि प्रत्यक्ष पीसीआर प्रविधि हो।यस प्राविधिक अवस्था अन्तर्गत, न्यूक्लिक एसिडलाई छुट्याउन र निकाल्न आवश्यक छैन, वस्तुको रूपमा टिस्यु नमूनालाई सीधै प्रयोग गर्नुहोस्, र PCR प्रतिक्रिया गर्न लक्षित जीन प्राइमरहरू थप्नुहोस्।

दोस्रो, प्रत्यक्ष पीसीआर प्रविधि परम्परागत डीएनए टेम्प्लेट प्रवर्द्धन प्रविधि मात्र होइन, तर यसमा आरएनए टेम्प्लेट रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन पीसीआर पनि समावेश छ।

तेस्रो, डाइरेक्ट पीसीआर प्रविधिले तन्तुका नमूनाहरूमा नियमित गुणात्मक पीसीआर प्रतिक्रियाहरू मात्र गर्दैन, तर यसले वास्तविक-समय क्यूपीसीआर प्रतिक्रियाहरू पनि समावेश गर्दछ, जसमा प्रतिक्रिया प्रणालीलाई बलियो एन्टि-बैकग्राउन्ड फ्लोरोसेन्स हस्तक्षेप क्षमता र अन्तर्जात फ्लोरोसेन्सले विरोधी क्षमतालाई शमन गर्न आवश्यक हुन्छ।

चौथो, डायरेक्ट पीसीआर प्रविधिद्वारा लक्षित नमूनाहरूलाई न्यूक्लिक एसिड टेम्प्लेटहरू मात्र रिलीज गर्न आवश्यक छ, र पीसीआर प्रतिक्रियामा हस्तक्षेप गर्ने प्रोटिन, पोलिसाकराइड, नुन आयनहरू, आदि हटाउँदैन।जसको लागि प्रतिक्रिया प्रणालीमा न्यूक्लिक एसिड पोलिमरेज र पीसीआर मिक्सलाई जटिल परिस्थितिहरूमा इन्जाइम गतिविधि र प्रतिकृति सटीकता सुनिश्चित गर्न उत्कृष्ट प्रतिरोध र अनुकूलन क्षमताको आवश्यकता पर्दछ।

पाँचौं, कुनै पनि न्यूक्लिक एसिड संवर्धन उपचार बिना प्रत्यक्ष पीसीआर प्रविधि द्वारा लक्षित टिश्यु नमूना र टेम्प्लेटको मात्रा धेरै सानो छ, जसमा प्रतिक्रिया प्रणालीलाई अत्यधिक उच्च संवेदनशीलता र एम्प्लीफिकेशन दक्षता चाहिन्छ।