प्राइमर डिजाइन आधार (99% समस्याहरू समाधान गर्न सकिन्छ)
1. प्राइमर लम्बाइ: पाठ्यपुस्तकलाई 15-30bp चाहिन्छ, सामान्यतया लगभग 20bp।वास्तविक अवस्था विशिष्टता सुनिश्चित गर्न 18-24bp हुनु राम्रो छ, तर जति लामो समय राम्रो हुन्छ, धेरै लामो प्राइमरले पनि विशिष्टता घटाउँछ, र उपज कम गर्छ।
2. प्राइमर एम्प्लीफिकेशन स्प्यान: 200-500bp उपयुक्त छ, र टुक्रालाई विशेष परिस्थितिहरूमा 10kb मा विस्तार गर्न सकिन्छ।
3. प्राइमर आधार: G+C को सामग्री 40-60% हुनुपर्छ, धेरै कम G+C प्रवर्धन प्रभाव राम्रो छैन, धेरै G+C गैर-विशिष्ट ब्यान्डहरू देखिन सजिलो छ।ATGC लाई 5 भन्दा बढी प्यूरिन वा पाइरिमिडिन न्यूक्लियोटाइडको क्लस्टरहरू बेवास्ता गरी अनियमित रूपमा वितरण गरिन्छ।स्थायित्व बढाउन 5′ अन्त्य र मध्यवर्ती अनुक्रमहरूको लागि बहु-gc, 3′ छेउमा रिच GC बेवास्ता गर्नुहोस्, अन्तिम 3 आधारहरूको लागि कुनै GC छैन, वा अन्तिम 5 आधारहरू मध्ये 3 को लागि कुनै GC छैन।
4. प्राइमरहरूमा सेकेन्डरी ढाँचाबाट जोगिनुहोस्, र दुई प्राइमरहरू बीचको पूरकताबाट बच्नुहोस्, विशेष गरी 3 'अन्तमा पूरक, अन्यथा प्राइमर डाइमर बन्नेछ र गैर-विशिष्ट एम्प्लीफाइड ब्यान्डहरू उत्पन्न हुनेछन्।
5. प्राइमरहरूको 3 'छेउमा रहेका आधारहरू, विशेष गरी अन्तिम र अन्तिम आधारहरू, जोड्न नसकिने टर्मिनल आधारहरूको कारणले PCR विफलताबाट बच्न कडा रूपमा जोडिएको हुनुपर्छ।
6. प्राइमरहरूमा उपयुक्त क्लीभेज साइटहरू छन् वा थप्न सकिन्छ, र एम्प्लीफाइड लक्ष्य अनुक्रममा उपयुक्त क्लीभेज साइटहरू हुनुपर्छ, जुन क्लीभेज विश्लेषण वा आणविक क्लोनिङका लागि धेरै लाभदायक हुन्छ।
7. प्राइमरहरूको विशिष्टता: प्राइमरहरूमा न्यूक्लिक एसिड अनुक्रम डेटाबेसमा अन्य अनुक्रमहरूसँग कुनै स्पष्ट समानता हुनु हुँदैन।
8. सफ्टवेयर प्रयोग गर्न सिक्नुहोस्: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (यो अनलाइन डिजाइन राम्रो काम गर्दछ)।
माथिको सामग्रीले कम्तिमा 99% प्राइमर डिजाइन समस्याहरू समाधान गर्न सक्छ।
प्राइमर डिजाइनको विवरणहरू नियन्त्रण गर्नुहोस्
1. प्राइमर लम्बाइ
सामान्य प्राइमर लम्बाइ 18 ~ 30 आधारहरू छन्।सामान्यतया, प्राइमरको एनिलिङ तापमान निर्धारण गर्ने सबैभन्दा महत्त्वपूर्ण कारक भनेको प्राइमरको लम्बाइ हो।प्राइमरको annealing तापमान सामान्यतया चयन गरिएको छ (Tm मान -5 ℃), र केहि प्रत्यक्ष रूपमा Tm मान प्रयोग गर्दछ।प्राइमरहरूको एनेलिङ तापक्रम मोटे रूपमा गणना गर्न निम्न सूत्रहरू प्रयोग गर्न सकिन्छ।
जब प्राइमरको लम्बाइ 20bp भन्दा कम हुन्छ: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
जब प्राइमरको लम्बाइ 20bp भन्दा बढी हुन्छ: 62.3℃+0.41℃(%GC)-500/लम्बाइ-5℃
यसको अतिरिक्त, धेरै सफ्टवेयर पनि annealing तापमान गणना गर्न प्रयोग गर्न सकिन्छ, गणना सिद्धान्त फरक हुनेछ, त्यसैले कहिलेकाहीं गणना मान एक सानो अंतर हुन सक्छ।PCR प्रतिक्रियाहरूलाई अनुकूलन गर्न, सबैभन्दा छोटो प्राइमरहरू जसले 54 ℃ भन्दा कम नहुने तापक्रम सुनिश्चित गर्दछ सबैभन्दा राम्रो दक्षता र विशिष्टताको लागि प्रयोग गरिन्छ।
समग्रमा, प्राइमर विशिष्टता प्रत्येक अतिरिक्त न्यूक्लियोटाइडको लागि चारको कारकले बढ्छ, जसले गर्दा अधिकांश अनुप्रयोगहरूको लागि न्यूनतम प्राइमर लम्बाइ 18 न्यूक्लियोटाइड हुन्छ।प्राइमर लम्बाइको माथिल्लो सीमा धेरै महत्त्वपूर्ण छैन, मुख्य रूपमा प्रतिक्रिया दक्षतासँग सम्बन्धित छ।एन्ट्रोपीको कारणले, प्राइमर जति लामो हुन्छ, DNA पोलिमरेजलाई बाँध्नका लागि स्थिर डबल-स्ट्र्यान्ड टेम्प्लेट बनाउनको लागि लक्ष्य DNA मा बाँध्न एनेल गर्ने दर त्यति नै कम हुन्छ।
प्राइमरहरू डिजाइन गर्न सफ्टवेयर प्रयोग गर्दा, प्राइमरहरूको लम्बाइ TM मानद्वारा निर्धारित गर्न सकिन्छ, विशेष गरी फ्लोरोसेन्स क्वान्टिटेटिभ PCR को प्राइमरहरूका लागि, TM=60℃ वा त्यसरी नियन्त्रण गर्नुपर्छ।
2.GC सामग्री
सामान्यतया, प्राइमर अनुक्रमहरूमा G+C को सामग्री 40% ~ 60% हुन्छ, र GC सामग्री र प्राइमरहरूको जोडीको Tm मान समन्वय गर्नुपर्छ।यदि प्राइमरमा गम्भीर GC वा AT प्रवृत्ति छ भने, A, T वा G र C टेलको उपयुक्त मात्रालाई प्राइमरको 5 'अन्तमा थप्न सकिन्छ।
3. एनिलिङ तापमान
annealing तापमान 5 ℃ unchain तापमान भन्दा कम हुनुपर्छ।यदि प्राइमर आधारहरूको संख्या सानो छ भने, एनिलिङ तापमान उचित रूपमा बढाउन सकिन्छ, जसले PCR को विशिष्टता बढाउन सक्छ।यदि आधारहरूको संख्या ठूलो छ भने, annealing तापमान उचित रूपमा कम गर्न सकिन्छ।4 ℃ ~ 6 ℃ को प्राइमर को एक जोडी बीच annealing तापमान भिन्नता PCR उपज को असर गर्दैन, तर आदर्श रूप मा एक जोडी प्राइमर को annealing तापमान समान छ, जो 55 ℃ ~ 75 ℃ को बीच फरक हुन सक्छ।
4. एम्प्लीफिकेशन टेम्प्लेटको माध्यमिक संरचना क्षेत्रबाट बच्नुहोस्
एम्प्लीफाइड खण्ड चयन गर्दा टेम्प्लेटको माध्यमिक संरचना क्षेत्रबाट बच्नु राम्रो हुन्छ।लक्ष्य टुक्राको स्थिर माध्यमिक संरचनालाई सान्दर्भिक कम्प्युटर सफ्टवेयरद्वारा भविष्यवाणी र अनुमान गर्न सकिन्छ, जुन टेम्प्लेट चयनको लागि उपयोगी छ।प्रायोगिक नतिजाहरूले देखाउँछन् कि विस्तार गर्ने क्षेत्रको मुक्त ऊर्जा (△G) 58.6lkJ/mol भन्दा कम हुँदा विस्तार प्रायः असफल हुन्छ।
5. लक्ष्य DNA संग बेमेल
जब एम्प्लीफाइड लक्ष्य DNA अनुक्रम ठूलो हुन्छ, प्राइमरले लक्ष्य DNA को धेरै भागहरूमा बाँध्न सक्छ, परिणाममा धेरै ब्यान्डहरू देखा पर्छन्।यस पटक यो BLAST सफ्टवेयर परीक्षण, वेबसाइट प्रयोग गर्न आवश्यक छ:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/।पङ्क्तिबद्ध दुई अनुक्रम (bl2seq) चयन गर्नुहोस्।
क्षेत्र १ मा प्राइमर अनुक्रमहरू टाँस्नु र जोन २ मा लक्षित DNA अनुक्रमहरू आदानप्रदानयोग्य छ, र BLAST ले पूरक, एन्टिसेन्स, र अन्य सम्भावनाहरूको गणना गर्दछ, त्यसैले प्रयोगकर्ताहरूले दुबै चेनहरू सेन्स चेनहरू हुन् कि भनेर ध्यान दिन आवश्यक पर्दैन।तपाईले GI नम्बर पनि प्रविष्ट गर्न सक्नुहुन्छ यदि तपाईलाई डेटाबेसमा अनुक्रमको GI नम्बर थाहा छ, त्यसैले तपाईले अनुक्रमको ठूलो खण्ड टाँस्नु पर्दैन।अन्तमा, 3 मा पङ्क्तिबद्ध गर्नुहोस् क्लिक गर्नुहोस् यदि प्राइमरमा लक्षित DNA मा बहुविध समरूप साइटहरू छन् भने।
6. प्राइमर टर्मिनल
प्राइमरको 3 'अन्तमा विस्तार सुरु हुन्छ, त्यसैले त्यहाँ सुरु हुनबाट बेमेलहरू रोक्न महत्त्वपूर्ण छ।3 'अन्त 3 लगातार G वा C भन्दा बढी हुनु हुँदैन, किनभने यसले G+C संवर्धन अनुक्रम क्षेत्रमा प्राइमरलाई गल्तीले ट्रिगर गर्नेछ।3' अन्त्यले कुनै पनि माध्यमिक संरचना बनाउन सक्दैन, विशेष PCR (AS-PCR) प्रतिक्रियाहरूमा बाहेक, प्राइमरको 3′ अन्त बेमेल हुन सक्दैन।उदाहरणका लागि, यदि एन्कोडिङ क्षेत्र एम्प्लीफाइड गरिएको छ भने, प्राइमरको 3 'छेउ कोडोनको तेस्रो स्थानमा समाप्त गरिनु हुँदैन, किनभने कोडोनको तेस्रो स्थान डिजेनेरेट हुने सम्भावना हुन्छ, जसले प्रवर्धनको विशिष्टता र दक्षतालाई असर गर्नेछ।एनेक्सेसन प्राइमरहरू प्रयोग गर्दा, कोडोन प्रयोग तालिकालाई सन्दर्भ गर्नुहोस्, जैविक प्राथमिकतामा ध्यान दिनुहोस्, 3′ अन्तमा एनेक्सेसन प्राइमरहरू प्रयोग नगर्नुहोस्, र प्राइमरहरूको उच्च सांद्रता (1uM-3uM) प्रयोग गर्नुहोस्।
7. प्राइमरहरूको माध्यमिक संरचना
प्राइमरहरू आफैंमा पूरक अनुक्रमहरू हुनुहुँदैन, अन्यथा प्राइमरहरू आफैं हेयरपिन संरचनाहरूमा फोल्ड हुनेछन्, र यो माध्यमिक संरचनाले स्टेरिक अवरोधका कारण प्राइमरहरू र टेम्प्लेटहरूको बन्धनलाई असर गर्नेछ।यदि कृत्रिम निर्णय प्रयोग गरिन्छ भने, प्राइमरहरूको निरन्तर पूरक आधारहरू 3bp भन्दा बढी हुनु हुँदैन।दुई प्राइमरहरू बीच कुनै पूरकता हुनु हुँदैन, विशेष गरी 3 'अन्तको पूरक ओभरल्यापलाई प्राइमर डाइमरहरूको गठन रोक्न बेवास्ता गर्नुपर्छ।सामान्यतया, प्राइमरको एक जोडीको बीचमा लगातार ४ भन्दा बढी आधारभूत समानता वा पूरकता हुनु हुँदैन।
8. मार्कर वा loci थप्नुहोस्
5 'अन्तले प्रवर्धन विशिष्टतामा थोरै प्रभाव पार्छ र यसैले एम्प्लीफिकेशन विशिष्टतालाई असर नगरी परिमार्जन गर्न सकिन्छ।प्राइमर 5 'अन्तको परिमार्जन समावेश: इन्जाइम प्रतिबन्ध साइट थप्दै;लेबल गरिएको बायोटिन, फ्लोरोसेन्स, डिगोक्सिन, Eu3+, आदि। प्रोटिन बाइन्डिङ DNA अनुक्रमहरू प्रस्तुत गर्नुहोस्;उत्परिवर्तन साइटहरू प्रस्तुत गर्ने, उत्परिवर्तन अनुक्रमहरू सम्मिलित गर्ने र छुटेको र प्रमोटर अनुक्रमहरू परिचय गर्ने, इत्यादि। अतिरिक्त आधारहरूले एम्प्लीफिकेशनको दक्षतालाई कम वा कम असर गर्नेछ र प्राइमर डाइमर गठनको सम्भावना बढाउनेछ, तर अर्को चरणको लागि केही छुटहरू दिइनु पर्छ।लक्ष्य अनुक्रममा अवस्थित नभएका अतिरिक्त अनुक्रमहरू, जस्तै प्रतिबन्ध साइटहरू र प्रमोटर अनुक्रमहरू, विशिष्टतालाई असर नगरी प्राइमरको 5′ अन्त्यमा थप्न सकिन्छ।यी अनुक्रमहरू प्राइमर Tm मानहरूको गणनामा समावेश गरिएका छैनन्, तर पूरकता र आन्तरिक माध्यमिक संरचनाको लागि परीक्षण गरिनुपर्छ।
९. सबक्लोनहरू
धेरै जसो समय, PCR प्रारम्भिक क्लोनिङ मात्र हो, र त्यसपछि हामीले लक्ष्य टुक्रालाई विभिन्न भेक्टरहरूमा सबक्लोन गर्न आवश्यक छ, त्यसैले हामीले PCR चरणमा अर्को सञ्चालनको लागि थप आधारहरू डिजाइन गर्न आवश्यक छ।
सबक्लोनिङका लागि डिजाइन गरिएका केही अनुक्रमहरू तल संक्षेपमा छन्।
प्रतिबन्ध endonuclease प्रतिबन्ध साइट थपियो
एन्जाइम प्रतिबन्ध साइटहरू थप्नु भनेको PCR उत्पादनहरू सबक्लोन गर्नको लागि सबैभन्दा सामान्य रूपमा प्रयोग हुने विधि हो।सामान्यतया, क्लीभेज साइट छ आधारहरू छन्, क्लीभेज साइटको 5 'अन्तको अतिरिक्त 2 ~ 3 सुरक्षात्मक आधारहरू थप्न आवश्यक छ।यद्यपि, विभिन्न इन्जाइमहरू द्वारा आवश्यक सुरक्षा आधारहरूको संख्या फरक छ।उदाहरणका लागि, SalⅠ लाई कुनै सुरक्षात्मक आधार चाहिन्छ, EcoRⅤ लाई 1 सुरक्षात्मक आधार चाहिन्छ, NotⅠ लाई 2 सुरक्षात्मक आधार चाहिन्छ, र HindⅢ लाई 3 सुरक्षात्मक आधारहरू चाहिन्छ।
LIC ले पुच्छर थप्छ
LIC को पूरा नाम Ligation-Independent cloning हो, Navogen द्वारा विशेष गरी pET भेक्टरको भागको लागि आविष्कार गरिएको क्लोनिङ विधि हो।एलआईसी विधिद्वारा तयार पारिएको पीईटी क्यारियरमा गैर-पूरक 12-15 आधार एकल स्ट्र्यान्ड स्टिकी छेउहरू छन्, जसले लक्ष्य इन्सर्ट टुक्रामा सम्बन्धित टाँसिने छेउहरूलाई पूरक बनाउँछ।एम्प्लीफिकेशन उद्देश्यका लागि, सम्मिलित खण्डको प्राइमर 5′ अनुक्रमले LIC भेक्टरलाई पूरक हुनुपर्छ।T4 DNA पोलिमरेजको 3′→5′ एक्स्ट्र्याक्ट गतिविधिले छोटो समय पछि सम्मिलित टुक्रामा एकल स्ट्र्यान्ड टाँसिने टुक्रा बनाउन सक्छ।किनकी उत्पादन केवल तयार सम्मिलित टुक्रा र भेक्टरको पारस्परिक annealing बाट गठन गर्न सकिन्छ, यो विधि धेरै छिटो र कुशल छ, र यो क्लोनिंग निर्देशित छ।
निर्देशित TA क्लोन पुच्छर थप्नुहोस्
TA क्लोनिङले भेक्टरमा टुक्रालाई लक्षित गर्न असमर्थ थियो, त्यसैले पछि Invitrogen ले क्लोनिङलाई लक्षित गर्न सक्ने भेक्टर प्रस्तुत गर्यो, जसमा एक छेउमा चार प्रमुख आधार GTGGS समावेश थियो।त्यसकारण, PCR प्राइमरहरूको डिजाइनमा, पूरक अनुक्रमहरू तदनुसार थपिनुपर्छ, ताकि टुक्राहरू "उन्मुख" हुन सकोस्।
यदि तपाइँ समय मा छोटो हुनुहुन्छ भने, तपाइँ प्रत्यक्ष संश्लेषण प्रयास गर्न सक्नुहुन्छ, भेक्टर संग जीन को संयोजन, जसलाई हामी म्युज्युलरिस्टहरुमा ET जीन संश्लेषण भन्छौं।
D. इन-फ्यूजन क्लोनिङ विधि
कुनै ligase आवश्यक छैन, कुनै लामो प्रतिक्रिया आवश्यक छैन।जबसम्म रेखीय भेक्टरको दुबै छेउमा अनुक्रम प्रस्तुत गरिन्छ तबसम्म प्राइमरको डिजाइनमा, PCR उत्पादन र रेखीय भेक्टरलाई BSA युक्त इन-फ्युजन इन्जाइम समाधानमा थपिन्छ र आधा घण्टाको लागि कोठाको तापक्रममा राखिन्छ, रूपान्तरण गर्न सकिन्छ।यो विधि ठूलो मात्रा रूपान्तरण लागि विशेष गरी उपयुक्त छ।
10. प्राइमर मर्ज गर्नुहोस्
कहिलेकाहीँ, प्राइमर डिजाइनको बारेमा सीमित अनुक्रम जानकारी मात्र थाहा हुन्छ।उदाहरणका लागि, यदि एमिनो एसिड अनुक्रम मात्र थाहा छ भने, मर्ज प्राइमर डिजाइन गर्न सकिन्छ।एक मर्जर प्राइमर एकल एमिनो एसिड इन्कोड गर्ने सबै विभिन्न आधार सम्भावनाहरू प्रतिनिधित्व गर्ने विभिन्न अनुक्रमहरूको मिश्रण हो।विशिष्टता बढाउनको लागि, तपाईले विभिन्न जीवहरूको आधार प्रयोग प्राथमिकताहरू अनुसार एनेक्सेसन कम गर्न कोडोन प्रयोग तालिकालाई सन्दर्भ गर्न सक्नुहुन्छ।Hypoxanthine लाई प्राइमर को annealing तापमान कम गर्न को लागी सबै आधारहरु संग जोड्न सकिन्छ।प्राइमरको 3′ छेउमा एनेक्स गरिएको आधारहरू प्रयोग नगर्नुहोस् किनभने 3′ छेउमा अन्तिम 3 आधारहरूको एनिलिङ गलत साइटमा PCR सुरु गर्न पर्याप्त छ।उच्च प्राइमर सांद्रता (1μM देखि 3μM) प्रयोग गरिन्छ किनभने धेरै एनेक्सेसन मिश्रणहरूमा प्राइमरहरू लक्षित टेम्प्लेटमा विशिष्ट छैनन्।
पीसीआर कच्चा मालनियन्त्रण
1. प्राइमर मात्रा
प्रत्येक प्राइमरको एकाग्रता 0.1 ~ 1umol वा 10 ~ 100pmol छ।यो प्राइमर को न्यूनतम मात्रा संग आवश्यक परिणाम उत्पादन गर्न राम्रो छ।प्राइमरको उच्च एकाग्रताले बेमेल र गैर-विशिष्ट प्रवर्द्धन निम्त्याउँछ, र प्राइमरहरू बीच डाइमर बन्ने सम्भावना बढाउँछ।
2. प्राइमर एकाग्रता
प्राइमर्सको एकाग्रताले विशिष्टतालाई असर गर्छ।इष्टतम प्राइमर एकाग्रता सामान्यतया 0.1 र 0.5μM को बीचमा हुन्छ।उच्च प्राइमर सांद्रताले गैर-विशिष्ट उत्पादनहरूको प्रवर्धन गर्न नेतृत्व गर्दछ।
3. प्राइमर को एनिलिङ तापमान
प्राइमरहरूको लागि अर्को महत्त्वपूर्ण मापदण्ड पग्लने तापमान (टीएम) हो।यो तापमान हो जब 50% प्राइमर र पूरक अनुक्रमहरू डबल-स्ट्र्यान्ड डीएनए अणुहरूको रूपमा प्रतिनिधित्व गरिन्छ।Tm PCR annealing तापमान सेट गर्न आवश्यक छ।आदर्श रूपमा, लक्ष्य अनुक्रमको साथ प्राइमरहरूको प्रभावकारी एनिलिङ सुनिश्चित गर्न एनेलिङ तापमान पर्याप्त कम छ, तर गैर-विशिष्ट बन्धन कम गर्न पर्याप्त उच्च छ।55 ℃ देखि 70 ℃ सम्म उचित annealing तापमान।एनिलिङको तापमान सामान्यतया प्राइमरको Tm भन्दा 5 ℃ कम सेट गरिन्छ।
Tm सेट गर्नका लागि धेरै सूत्रहरू छन्, जुन प्रयोग गरिएको सूत्र र प्राइमरहरूको अनुक्रममा निर्भर गर्दछ।किनभने धेरै सूत्रहरूले अनुमानित Tm मान प्रदान गर्दछ, सबै annealing तापमान केवल एक सुरूवात बिन्दु हो।विशिष्टतालाई धेरै प्रतिक्रियाहरू विश्लेषण गरेर सुधार गर्न सकिन्छ जुन क्रमिक रूपमा एनेलिङ तापमान बढाउँछ।अनुमानित Tm-5 ℃ तल सुरु गर्नुहोस्, र बिस्तारै 2℃ को वृद्धि मा annealing तापमान बढाउनुहोस्।उच्च एनेलिङ तापक्रमले प्राइमर डाइमर र गैर-विशिष्ट उत्पादनहरूको गठनलाई कम गर्नेछ।उत्कृष्ट परिणामहरूको लागि, दुई प्राइमरहरूमा अनुमानित Tm मानहरू हुनुपर्छ।यदि प्राइमर जोडीहरूको Tm भिन्नता 5℃ भन्दा बढी छ भने, प्राइमरहरूले चक्रमा कम एनिलिङ तापमान प्रयोग गरेर महत्त्वपूर्ण गलत सुरुवात देखाउनेछन्।यदि दुई प्राइमर Tm फरक छन् भने, annealing तापमान न्यूनतम Tm भन्दा कम 5℃ मा सेट गर्नुहोस्।वैकल्पिक रूपमा, विशिष्टता बढाउनको लागि, पाँच चक्रहरू पहिले उच्च Tm को लागि डिजाइन गरिएको annealing तापमानमा प्रदर्शन गर्न सकिन्छ, त्यसपछि बाँकी चक्रहरू कम Tm को लागि डिजाइन गरिएको annealing तापमानमा।यसले गन्तव्य टेम्प्लेटको आंशिक प्रतिलिपिलाई कडा परिस्थितिहरूमा प्राप्त गर्न अनुमति दिन्छ।
4. प्राइमर शुद्धता र स्थिरता
अनुकूलन प्राइमरहरूको मानक शुद्धता धेरै जसो PCR अनुप्रयोगहरूको लागि पर्याप्त छ।बेन्जोयल र आइसोब्युटाइल समूहहरूलाई डिसल्टिङद्वारा हटाउने कार्य न्यून हुन्छ र त्यसैले PCR मा हस्तक्षेप गर्दैन।केही अनुप्रयोगहरूलाई संश्लेषण प्रक्रियामा कुनै पनि गैर-पूर्ण-लम्बाइ अनुक्रमहरू हटाउन शुद्धीकरण आवश्यक पर्दछ।यी काटिएका अनुक्रमहरू हुन्छन् किनभने DNA संश्लेषण रसायनको दक्षता 100% छैन।यो एक गोलाकार प्रक्रिया हो जसले बारम्बार रासायनिक प्रतिक्रियाहरू प्रयोग गर्दछ किनकि प्रत्येक आधारलाई 3′ देखि 5′ सम्म DNA बनाउनको लागि जोडिन्छ।तपाईं कुनै पनि चक्रमा असफल हुन सक्नुहुन्छ।लामो प्राइमरहरू, विशेष गरी ती 50 भन्दा ठूला आधारहरूमा, काटिएका अनुक्रमहरूको ठूलो अनुपात हुन्छ र शुद्धिकरण आवश्यक हुन सक्छ।
प्राइमरको उत्पादन सिंथेटिक रसायन र शुद्धिकरण विधिको दक्षताले प्रभावित हुन्छ।बायोफार्मास्युटिकल कम्पनीहरू, जस्तै साइटोलोजी र शेङ्गोङ, सबैले ओलिगोन्यूक्लियोसाइडको कुल उत्पादन सुनिश्चित गर्न न्यूनतम OD एकाइ प्रयोग गर्छन्।कस्टम प्राइमरहरू सुक्खा पाउडरको रूपमा पठाइन्छ।प्राइमरहरूलाई TE मा पुन: घुलन गर्न उत्तम हुन्छ ताकि अन्तिम एकाग्रता 100μM होस्।TE डियोनाइज्ड पानी भन्दा राम्रो छ किनभने पानीको pH प्रायः अम्लीय हुन्छ र यसले ओलिगोन्यूक्लियोसाइडको हाइड्रोलाइसिस निम्त्याउँछ।
प्राइमरको स्थिरता भण्डारण अवस्थाहरूमा निर्भर गर्दछ।सुख्खा पाउडर र भंग प्राइमर -20 ℃ मा भण्डारण गर्नुपर्छ।10μM भन्दा बढी सांद्रतामा TE मा घुलनशील प्राइमरहरू स्थिर रूपमा -20℃ मा 6 महिनाको लागि भण्डारण गर्न सकिन्छ, तर कोठाको तापक्रम (15℃ देखि 30℃) मा १ हप्ता भन्दा कमको लागि मात्र भण्डारण गर्न सकिन्छ।सुख्खा पाउडर प्राइमर कम्तिमा 1 वर्षको लागि -20 C मा र कोठाको तापमान (15 C देखि 30 C) मा 2 महिना सम्म भण्डारण गर्न सकिन्छ।
5. इन्जाइम र तिनीहरूको सांद्रता
हाल, प्रयोग गरिएको Taq DNA पोलिमरेज मूलतया कोलिफर्म ब्याक्टेरिया द्वारा संश्लेषित जीन इन्जिनियरिङ इन्जाइम हो।सामान्य PCR प्रतिक्रियालाई उत्प्रेरित गर्न आवश्यक इन्जाइमको मात्रा लगभग 2.5U हुन्छ (100ul को कुल प्रतिक्रिया मात्रालाई बुझाउँछ)।यदि एकाग्रता धेरै उच्च छ भने, यसले गैर-विशिष्ट प्रवर्धन गर्न सक्छ;एकाग्रता धेरै कम छ भने, सिंथेटिक उत्पादन को मात्रा कम हुनेछ।
6. dNTP को गुणस्तर र एकाग्रता
dNTP को गुणस्तर एकाग्रता र PCR प्रवर्धन को दक्षता संग नजिकको सम्बन्ध छ।dNTP पाउडर दानेदार छ, र यसको परिवर्तनशीलताले यसको जैविक गतिविधि गुमाउँछ यदि यो अनुचित रूपमा भण्डारण गरिएको छ।dNTP समाधान अम्लीय छ, र 1M NaOH वा 1M Tris.HCL बफर समाधानको साथ उच्च एकाग्रतामा यसको PH 7.0 ~ 7.5 मा समायोजन गर्न, उप-प्याकेजिङको सानो मात्रा, -20℃ मा जमेको भण्डारण प्रयोग गर्नुपर्छ।धेरै फ्रिज-पघल्दा dNTP लाई घटाउनेछ।PCR प्रतिक्रियामा, dNTP 50 ~ 200umol/L हुनुपर्छ।विशेष गरी, ध्यान दिनु पर्छ चार DNTPS को एकाग्रता बराबर हुनुपर्छ (समान तिल तयारी)।यदि तिनीहरू मध्ये कुनै एकको एकाग्रता अन्य (उच्च वा तल्लो) भन्दा फरक छ भने, बेमेलको कारण हुनेछ।धेरै कम एकाग्रताले PCR उत्पादनहरूको उत्पादनलाई कम गर्नेछ।dNTP Mg2+ सँग जोड्न सक्छ र नि: शुल्क Mg2+ को एकाग्रता कम गर्न सक्छ।
7. टेम्प्लेट (लक्ष्य जीन) न्यूक्लिक एसिड
टेम्प्लेट न्यूक्लिक एसिडको मात्रा र शुद्धिकरण डिग्री PCR को सफलता वा असफलताको लागि प्रमुख लिङ्कहरू मध्ये एक हो।परम्परागत डीएनए शुद्धिकरण विधिहरूले सामान्यतया SDS र प्रोटीज K प्रयोग गर्दछ नमूनाहरू पचाउन र डिस्पोज गर्न।SDS को मुख्य कार्यहरू हुन्: कोशिका झिल्लीमा लिपिड र प्रोटिनहरू भंग गर्ने, यसरी झिल्ली प्रोटीनहरू विघटन गरेर कोशिका झिल्लीलाई नष्ट गर्ने, र कोशिकामा आणविक प्रोटीनहरू छुट्याएर, SDS ले प्रोटीनहरू र अवक्षेपणसँग पनि संयोजन गर्न सक्छ;Protease K ले प्रोटीनहरू हाइड्रोलाइज गर्न र पचाउन सक्छ, विशेष गरी DNA सँग बाँधिएका हिस्टोनहरू, र त्यसपछि प्रोटिनहरू र अन्य सेल कम्पोनेन्टहरू निकाल्नको लागि जैविक विलायक फिनोल र क्लोरोफर्म प्रयोग गर्न सक्छ, र न्यूक्लिक एसिडलाई उत्तेजित गर्न इथेनोल वा आइसोप्रोपाइल अल्कोहल प्रयोग गर्दछ।निकालिएको न्यूक्लिक एसिड PCR प्रतिक्रियाहरूको लागि टेम्प्लेटको रूपमा प्रयोग गर्न सकिन्छ।सामान्य क्लिनिकल पत्ता लगाउने नमूनाहरूको लागि, द्रुत र सरल विधि कोशिकाहरू विघटन गर्न, रोगजनक लाइसेट गर्न, क्रोमोजोमहरूबाट मुक्त लक्ष्य जीनहरूमा प्रोटीनहरू पचाउन र हटाउन, र प्रत्यक्ष रूपमा PCR प्रवर्धनको लागि प्रयोग गर्न सकिन्छ।आरएनए टेम्प्लेट निकासीले सामान्यतया गुआनिडाइन आइसोथियोसाइनेट वा प्रोटीज K विधि प्रयोग गर्दछ RNase लाई अपमानजनक हुनबाट रोक्नको लागि।
8.Mg2+ एकाग्रता
Mg2+ ले PCR प्रवर्धनको विशिष्टता र उपजमा महत्त्वपूर्ण प्रभाव पार्छ।सामान्य PCR प्रतिक्रियामा, जब विभिन्न dNTP को एकाग्रता 200umol/L हुन्छ, Mg2+ को उपयुक्त एकाग्रता 1.5 ~ 2.0mmol/L हुन्छ।Mg2+ एकाग्रता धेरै उच्च छ, प्रतिक्रिया विशिष्टता घट्छ, गैर-विशिष्ट प्रवर्धन हुन्छ, धेरै कम एकाग्रताले Taq DNA पोलिमरेजको गतिविधिलाई कम गर्दछ, परिणामस्वरूप प्रतिक्रिया उत्पादनहरूको कमी हुन्छ।
म्याग्नेसियम आयनहरूले PCR का धेरै पक्षहरूलाई असर गर्छ, जस्तै DNA पोलिमरेज गतिविधि, जसले उपजलाई असर गर्छ;अर्को उदाहरण प्राइमर एनिलिङ हो, जसले विशिष्टतालाई असर गर्छ।dNTP र टेम्प्लेट म्याग्नेसियम आयनसँग बाँध्छ, इन्जाइम गतिविधिको लागि आवश्यक नि: शुल्क म्याग्नेसियम आयनको मात्रा कम गर्दछ।इष्टतम म्याग्नेसियम आयन एकाग्रता विभिन्न प्राइमर जोडी र टेम्प्लेटहरूको लागि भिन्न हुन्छ, तर 200μM dNTP सँग 1.5mM सुरु हुने सामान्य PCR एकाग्रता हो (नोट: वास्तविक-समय मात्रात्मक PCR को लागि, फ्लोरोसेन्ट प्रोबको साथ 3 देखि 5mM म्याग्नेसियम आयन समाधान प्रयोग गर्नुहोस्)।नि:शुल्क म्याग्नेसियम आयनहरूको उच्च सांद्रताले उपज बढाउँछ, तर गैर-विशिष्ट प्रवर्धन पनि बढाउँछ र निष्ठा घटाउँछ।इष्टतम एकाग्रता निर्धारण गर्न, म्याग्नेसियम आयन टाइट्रेसनहरू 0.5mM को वृद्धिमा 1mM देखि 3mM सम्म प्रदर्शन गरिएको थियो।म्याग्नेसियम आयन अनुकूलन मा निर्भरता कम गर्न, प्लेटिनम Taq DNA पोलिमरेज प्रयोग गर्न सकिन्छ।प्लेटिनम Taq DNA पोलिमरेज Taq DNA पोलिमरेज भन्दा म्याग्नेसियम आयन सांद्रताको फराकिलो दायरामा कार्य कायम राख्न सक्षम छ र त्यसैले कम अनुकूलन आवश्यक छ।
9. Pcr-प्रवर्धन additives
एनेलिङ तापमान, प्राइमर डिजाइन, र म्याग्नेसियम आयन एकाग्रता को अनुकूलन धेरै टेम्प्लेट को अत्यधिक विशिष्ट प्रवर्धन को लागी पर्याप्त छ;यद्यपि, उच्च GC सामग्री सहित केही टेम्प्लेटहरूलाई थप उपायहरू आवश्यक पर्दछ।DNA को पग्लने तापमानलाई असर गर्ने additives ले उत्पादन विशिष्टता र उपज सुधार गर्न अर्को तरिका प्रदान गर्दछ।उत्कृष्ट नतिजाहरूको लागि टेम्प्लेटको पूर्ण विकृति आवश्यक छ।
थप रूपमा, माध्यमिक संरचनाले प्राइमर बाइन्डिङ र इन्जाइम विस्तारलाई रोक्छ।
PCR additives, foramide, DMSO, glycerin, betaine, र PCRx Enhancer Solution सहित, प्रवर्द्धन बढाउँछ।तिनीहरूको सम्भावित संयन्त्र भनेको पिघलिएको तापक्रम घटाउनु हो, यसरी प्राइमरहरूको एनिलिङमा सहायता गर्नु र माध्यमिक संरचना क्षेत्र मार्फत DNA पोलिमरेज विस्तारलाई सहयोग गर्नु हो।PCRx समाधानका अन्य फाइदाहरू छन्।प्लेटिनम टाक डीएनए पोलिमरेज र प्लेटिनम पीएफएक्स डीएनए पोलिमरेजसँग प्रयोग गर्दा न्यूनतम म्याग्नेसियम आयन अप्टिमाइजेसन आवश्यक हुन्छ।यसैले, प्लेटिनम प्रविधि तेस्रो दृष्टिकोण, म्याग्नेशियम आयन अनुकूलन को निर्भरता कम गर्दा विशिष्टता वृद्धि गर्न additive संग जोडिएको छ।उत्कृष्ट नतिजाहरूको लागि, additives को एकाग्रता अनुकूलित हुनुपर्छ, विशेष गरी DMSO, formamide, र glycerol, जसले Taq DNA पोलिमरेजलाई रोक्छ।
10. तातो सुरुवात
राम्रो प्राइमर डिजाइनको अतिरिक्त PCR विशिष्टता सुधार गर्न हट स्टार्ट PCR सबैभन्दा महत्त्वपूर्ण विधिहरू मध्ये एक हो।यद्यपि Taq DNA पोलिमरेजको इष्टतम लम्बाइको तापमान 72 ℃ हो, पोलिमरेज कोठाको तापक्रममा सक्रिय रहन्छ।यसरी, गैर-विशिष्ट उत्पादनहरू उत्पादन गरिन्छ जब PCR प्रतिक्रियाको तयारीको क्रममा र थर्मल चक्रको सुरुमा होल्डिंग तापमान एनिलिङ तापमान भन्दा कम हुन्छ।एक पटक गठन भएपछि, यी गैर-विशिष्ट उत्पादनहरू प्रभावकारी रूपमा विस्तारित हुन्छन्।हट-स्टार्ट PCR विशेष गरी प्रभावकारी हुन्छ जब प्राइमर डिजाइनको लागि प्रयोग गरिएका साइटहरू आनुवंशिक तत्वहरूको स्थानद्वारा सीमित हुन्छन्, जस्तै साइट-निर्देशित उत्परिवर्तन, अभिव्यक्ति क्लोनिङ, वा DNA इन्जिनियरिङका लागि प्रयोग हुने आनुवंशिक तत्वहरूको निर्माण र हेरफेर।
Taq DNA पोलिमरेजको गतिविधिलाई सीमित गर्ने एउटा सामान्य विधि भनेको बरफमा PCR प्रतिक्रिया समाधान तयार गर्नु हो र यसलाई पूर्व तताइएको PCR उपकरणमा राख्नु हो।यो विधि सरल र सस्तो छ, तर यसले इन्जाइमको गतिविधि पूरा गर्दैन र यसैले गैर-विशिष्ट उत्पादनहरूको प्रवर्धनलाई पूर्ण रूपमा हटाउन सक्दैन।
थर्मल प्राइमिङले पीसीआर उपकरणले डिनेचुरेसन तापक्रममा नपुगेसम्म आवश्यक कम्पोनेन्टलाई रोकेर डीएनए संश्लेषणमा ढिलाइ गर्छ।टाक डीएनए पोलिमरेजको ढिलाइ थप्ने सहित धेरै म्यानुअल थर्मल इनिशिएशन विधिहरू, विशेष गरी उच्च-थ्रुपुट अनुप्रयोगहरूको लागि, जटिल छन्।अन्य थर्मल प्राइमिङ विधिहरूले म्याग्नेसियम आयनहरू वा इन्जाइमहरू सहित, वा टेम्प्लेटहरू र बफरहरू जस्ता प्रतिक्रियाशील घटकहरूलाई शारीरिक रूपमा अलग गर्नको लागि आवश्यक कम्पोनेन्ट संलग्न गर्न मोम ढाल प्रयोग गर्दछ।थर्मल चक्रको समयमा, विभिन्न घटकहरू रिलिज हुन्छन् र मोम पग्लिएपछि एकसाथ मिसिन्छन्।म्यानुअल हट स्टार्ट विधि जस्तै, मोम ढाल विधि बोझिलो र दूषित हुने सम्भावना हुन्छ र उच्च थ्रुपुट अनुप्रयोगहरूको लागि उपयुक्त छैन।
प्लेटिनम डीएनए पोलिमरेज स्वचालित हट स्टार्ट पीसीआरको लागि सुविधाजनक र कुशल छ।प्लेटिनम टाक डीएनए पोलिमरेजमा टाक डीएनए पोलिमरेजको बिरूद्ध मोनोक्लोनल एन्टिबडीसँग मिलेर पुनः संयोजक टाक डीएनए पोलिमरेज हुन्छ।एन्टिबडीहरू PCR द्वारा लामो समयसम्म तापक्रम होल्डिंगको समयमा इन्जाइम गतिविधिलाई रोक्नको लागि तयार गरिन्छ।Taq DNA पोलिमरेज पूर्ण पोलिमरेज गतिविधि पुनर्स्थापित गर्दै, विकृतीकरण चरणको 94 ℃ इन्सुलेशनको समयमा प्रतिक्रियामा जारी गरिएको थियो।थर्मल प्रारम्भको लागि रासायनिक रूपमा परिमार्जित Taq DNA पोलिमरेजको विपरीत, प्लेटिनम इन्जाइमलाई पोलिमरेज सक्रिय गर्न 94℃ (10 देखि 15 मिनेट) मा लामो इन्सुलेशन आवश्यक पर्दैन।PlatinumTaq DNA पोलिमरेजको साथ, Taq DNA पोलिमरेज गतिविधिको 90% 2 मिनेट पछि 94℃ मा पुनर्स्थापित गरियो।
11. Nest-PCR
नेस्टेड प्राइमरहरू प्रयोग गरेर एम्प्लीफिकेशनको क्रमिक राउन्डहरूले विशिष्टता र संवेदनशीलता सुधार गर्न सक्छ।पहिलो राउन्ड 15 देखि 20 चक्रहरूको मानक प्रवर्धन हो।प्रारम्भिक एम्प्लीफिकेशन उत्पादनको सानो अंश १०० देखि १००० पटक पातलो गरिएको थियो र 15 देखि 20 चक्रहरूको लागि प्रवर्धनको दोस्रो चरणमा थपियो।वैकल्पिक रूपमा, प्रारम्भिक एम्प्लीफाइड उत्पादन जेल शुद्धीकरण द्वारा आकार गर्न सकिन्छ।एम्प्लीफिकेशनको दोस्रो राउन्डमा नेस्टेड प्राइमर प्रयोग गरिन्छ, जुन पहिलो प्राइमर भित्र लक्षित अनुक्रममा बाँध्न सक्छ।नेस्टेड PCR को प्रयोगले धेरै लक्षित साइटहरूको एम्प्लीफिकेशनको सम्भावनालाई कम गर्छ किनभने त्यहाँ प्राइमरका दुवै सेटहरूमा केही लक्ष्य अनुक्रमहरू पूरक हुन्छन्।एउटै प्राइमरहरूको साथमा एउटै कुल संख्या (३० देखि ४०) ले अविशिष्ट साइटहरूलाई बढायो।नेस्टेड PCR ले सीमित लक्ष्य अनुक्रमहरू (जस्तै, दुर्लभ mrnas) को संवेदनशीलता बढाउँछ र कठिन PCRS (जस्तै 5′ RACE) को विशिष्टता सुधार गर्दछ।
12. घट्दो PCR
घट्दो PCR ले PCR को पहिलो केही चक्रहरूको लागि कडा एनिलिङ अवस्थाहरू प्रयोग गरेर विशिष्टता सुधार गर्दछ।चक्र अनुमानित Tm भन्दा लगभग 5 ℃ उच्च annealing तापमान मा सुरु हुन्छ, त्यसपछि annealing तापमान Tm 5 ℃ भन्दा कम नभएसम्म प्रत्येक चक्र 1 ℃ देखि 2 ℃ सम्म घटाइन्छ।उच्चतम समानता भएको गन्तव्य टेम्प्लेट मात्र विस्तार गरिनेछ।यी उत्पादनहरू पछिल्ला चक्रहरूमा विस्तार गर्न जारी राख्छन्, एम्प्लीफाइड गैर-विशिष्ट उत्पादनहरू भीड गर्दै।घट्दो पीसीआर विधिहरूका लागि उपयोगी छ जहाँ प्राइमर र लक्ष्य टेम्प्लेट बीचको समरूपताको डिग्री थाहा छैन, जस्तै AFLP DNA फिंगरप्रिन्टिङ।
सम्बन्धित PCR किटहरू
2× पीसीआर हीरोTMमिक्स प्रणालीमा सामान्य पीसीआर मिक्स प्रणाली भन्दा पीसीआर अवरोधकहरूलाई उच्च सहनशीलता छ, र सजिलैसँग विभिन्न जटिल टेम्प्लेटहरूको पीसीआर प्रवर्धनसँग सामना गर्न सक्छ।अद्वितीय प्रतिक्रिया प्रणाली र उच्च दक्षता Taq Hero ले PCR प्रतिक्रियालाई उच्च प्रवर्द्धन दक्षता, विशिष्टता र संवेदनशीलता प्रदान गर्दछ।
उच्च प्रवर्धन दक्षता
यसमा 5'→3' DNA पोलिमरेज गतिविधि र 5'→3' exonuclease गतिविधि छ, 3'→5' exonuclease गतिविधि बिना।
वास्तविक समय PCR Easyᵀᴹ-SYBR ग्रीन I किट
विशिष्ट-अनुकूलित बफर र हट-स्टार्ट Taq इन्जाइमले गैर-विशिष्ट प्रवर्धन र प्राइमर डाइमर गठनलाई रोक्न सक्छ।
उच्च संवेदनशीलता - टेम्प्लेटको कम प्रतिलिपिहरू पत्ता लगाउन सक्छ
किटले प्रवर्द्धन दक्षता र प्रतिक्रियाको विशिष्टतालाई प्रभावकारी रूपमा सुधार गर्नको लागि एक अद्वितीय फोरजीन रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन अभिकर्मक र Foregene HotStar Taq DNA पोलिमरेज प्रयोग गर्दछ।
पोस्ट समय: मे-०९-२०२३
