PCR अभिकर्मकहरूको प्रारम्भिक चरणमा प्राइमरहरू र प्रोबहरूको कार्यसम्पादन प्रमाणीकरण र सबैभन्दा उपयुक्त प्रतिक्रिया अवस्थाहरू निर्धारण गर्नु औपचारिक प्रयोगहरूको सहज प्रगति सुनिश्चित गर्नका लागि आवश्यक शर्तहरू हुन्।
त्यसोभए हामीले प्रारम्भिक चरणमा प्राइमर प्रोब कसरी पुष्टि गर्न आवश्यक छ?
मुख्य सूचकहरू आधार रेखा, एम्प्लीफिकेशन कर्भ, सीटी मान, प्रवर्धन दक्षता, कम-सांद्रता नमूना पत्ता लगाउने, CV, आदि हुन्।
आधार रेखा
आधार रेखा PCR प्रवर्द्धन वक्र मा तेर्सो रेखा हो।PCR प्रवर्द्धन प्रतिक्रियाको पहिलो केही चक्रहरूमा, प्रतिदीप्ति संकेत धेरै परिवर्तन गर्दैन र एक सीधा रेखा बनाउँछ।यो सीधा रेखा आधार रेखा हो।
PCR प्राइमर प्रोबहरू स्क्रिन गर्दा, आधार रेखा स्तर हो कि होइन भनेर ध्यान दिनुहोस्।प्राइमर प्रोब एकाग्रताको शुद्धताले आधार रेखालाई असर गर्छ, जस्तै आधार रेखालाई बढ्न वा पतन गर्न।आधार रेखा पनि एक धेरै सहज सूचक हो।
प्रवर्धन वक्र
अर्को सहज संकेतक प्रवर्धन वक्र को आकार हो।माध्यमिक प्रवर्द्धन वा अन्य असामान्य प्रवर्धन वक्रहरूबाट बच्नको लागि एस आकारको वक्र हुनु उत्तम हुन्छ।
Ct मान
आधार रेखा देखि घातीय वृद्धि सम्मको इन्फ्लेक्शन बिन्दुसँग सम्बन्धित चक्रहरूको संख्या Ct मान हो।
एउटै नमूनाको लागि, विभिन्न प्राइमर प्रोबहरूले फरक एम्प्लीफिकेशन कर्भहरूमा परिणाम दिन्छ, र सम्बन्धित Ct मान प्रवर्धन दक्षता र हस्तक्षेप डिग्रीद्वारा प्रभावित हुनेछ।सिद्धान्तमा, हामीले छनौट गर्ने प्राइमर प्रोबको Ct मान जति सानो हुन्छ, त्यति राम्रो हुन्छ।
प्रवर्धन दक्षता
PCR प्रवर्द्धन दक्षता मूल्याङ्कन गर्नका लागि सबैभन्दा भरपर्दो र स्थिर विधिहरू मध्ये एक मानक वक्र हो, जुन शोधकर्ताहरूले पनि व्यापक रूपमा मान्यता पाएका छन्।विधिले लक्ष्य टेम्प्लेटहरूको सापेक्ष संख्या नियन्त्रण गर्न नमूनाहरूको श्रृंखला बनाउन समावेश गर्दछ।यी नमूनाहरू प्राय: केन्द्रित स्टक समाधानहरूको क्रमिक dilutions द्वारा बनाइन्छ, सबैभन्दा सामान्य रूपमा प्रयोग 10-गुना कमजोरी हो।पातलो नमूनाहरूको शृङ्खला प्रयोग गर्दै, मानक qPCR कार्यक्रम प्रयोग गरेर Cq मान प्राप्त गर्न विस्तार गर्न, र अन्तमा प्रत्येक नमूनाको एकाग्रता र रेखीय समीकरण Cq= -klgX0+b प्राप्त गर्न सम्बन्धित Cq मान अनुसार मानक वक्र कोर्नुहोस्, र प्रवर्धन दक्षता E=10(-1 /k1)-।मात्रात्मक विश्लेषणको लागि qPCR प्रयोग गर्दा, प्रवर्धन दक्षता 90%-110% (3.6>k>3.1) को दायरामा हुन आवश्यक छ।
कम एकाग्रता नमूना पत्ता लगाउने
जब नमूना एकाग्रता कम हुन्छ, विभिन्न प्राइमर प्रोबहरूको पत्ता लगाउने दरहरू फरक हुन्छन्।हामी नक्कल गर्न 20 कम-सांद्रता नमूनाहरू चयन गर्छौं, र उच्चतम पत्ता लगाउने दर भएको प्राइमर-प्रोब प्रणाली सबैभन्दा राम्रो हो।
भिन्नता को गुणांक (CV)
10 डुप्लिकेट नमूनाहरू न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन पत्ता लगाउन अभिकर्मकको लाइन मानक अनुसार विभिन्न प्राइमर प्रोबहरू पत्ता लगाउन सकिन्छ।
मात्रात्मक अभिकर्मक:
शुद्धता
एक ब्याच भित्र शुद्धता पूरा गर्नुपर्छ: भिन्नता को गुणांक (CV,%) परीक्षण एकाग्रता को logarithmic मान ≤5% हो।जब नमूना एकाग्रता कम हुन्छ, पत्ता लगाउने एकाग्रताको लगरिथमको भिन्नताको गुणांक (CV,%) ≤10% हुन्छ।
गुणात्मक अभिकर्मकहरू:
शुद्धता
एक ब्याच भित्र शुद्धता पूरा गर्नुपर्छ:
(1) Ct मानको भिन्नताको गुणांक (CV,%) ≤5%
एउटै नमूना 10 पटक समानान्तरमा परीक्षण गरिन्छ, र परीक्षण परिणामहरू एकरूप हुनुपर्छ
पोस्ट समय: सेप्टेम्बर-18-2021
