• PCR भनेको थोरै मात्रामा DNA टेम्प्लेटबाट DNA विस्तार गर्न प्रयोग गरिने विधि हो।RT-PCR ले RNA स्रोतबाट DNA टेम्प्लेट उत्पादन गर्न रिभर्स ट्रान्सक्रिप्सन प्रयोग गर्दछ जुन त्यसपछि विस्तार गर्न सकिन्छ।
• PCR र RT-PCR सामान्यतया अन्तिम बिन्दु प्रतिक्रियाहरू हुन्, जबकि qPCR र RT-qPCR ले PCR प्रतिक्रियाको समयमा उत्पाद संश्लेषणको गतिको गतिको प्रयोग गर्दछ टेम्प्लेटको मात्रा परिमाण गर्न।
• नयाँ विधिहरू, जस्तै डिजिटल PCR, प्रारम्भिक DNA टेम्प्लेटको पूर्ण मात्रा प्रदान गर्दछ, जबकि isothermal PCR जस्ता विधिहरूले विश्वसनीय परिणामहरू प्रदान गर्न महँगो उपकरणहरूको आवश्यकतालाई कम गर्छ।

पोलिमरेज चेन रियाक्सन (PCR) एक अपेक्षाकृत सरल र व्यापक रूपमा प्रयोग हुने आणविक जीवविज्ञान प्रविधि हो जुन DNA र RNA अनुक्रमहरू विस्तार गर्न र पत्ता लगाउनको लागि हो।DNA क्लोनिङ र एम्प्लीफिकेशनको परम्परागत विधिहरूको तुलनामा, जसमा प्राय दिन लाग्न सक्छ, PCR लाई केही घण्टा मात्र चाहिन्छ।PCR अत्यधिक संवेदनशील छ र विशिष्ट अनुक्रमहरूको पत्ता लगाउन र प्रवर्धनको लागि न्यूनतम टेम्प्लेट चाहिन्छ।आधारभूत पीसीआर विधिहरू साधारण डीएनए र आरएनए पत्ता लगाउनबाट थप उन्नत भएका छन्।तल, हामीले तपाईंको अनुसन्धान आवश्यकताहरूको लागि एन्जो लाइफ साइन्सेसमा उपलब्ध गराइएका विभिन्न PCR विधिहरू र अभिकर्मकहरूको सिंहावलोकन प्रदान गरेका छौं।हामी वैज्ञानिकहरूलाई उनीहरूको अर्को अनुसन्धान परियोजनामा ​​PCR अभिकर्मकहरू छिटो पहुँच गर्न मद्दत गर्ने लक्ष्य राख्छौं!

PCR

मानक PCR को लागी, तपाईलाई DNA पोलिमरेज, म्याग्नेसियम, न्यूक्लियोटाइड्स, प्राइमर, एम्प्लीफाइड गर्न को लागी DNA टेम्प्लेट, र एक थर्मोसाइकल आवश्यक छ।PCR संयन्त्र यसको उद्देश्य जत्तिकै सरल छ: 1) डबल-स्ट्र्यान्डेड DNA (dsDNA) तातो विकृत छ, 2) प्राइमरहरू एकल DNA स्ट्र्यान्डमा पङ्क्तिबद्ध छन्, र 3) प्राइमरहरू DNA पोलिमरेजद्वारा विस्तारित छन्, परिणामस्वरूप दुई प्रतिहरू छन्। मूल DNA स्ट्र्यान्ड।तापमान र समयहरूको एक श्रृंखलामा विकृतीकरण, एनेलिङ, र लम्बाइ प्रक्रियालाई एम्प्लीफिकेशनको एक चक्र (चित्र 1) भनिन्छ।

चक्रको प्रत्येक चरण प्रयोग गरिएको टेम्प्लेट र प्राइमर सेटको लागि अनुकूलित हुनुपर्छ।यो चक्र लगभग 20-40 पटक दोहोर्याइएको छ, र एम्प्लीफाइड उत्पादन को विश्लेषण गर्न सकिन्छ, सामान्यतया agarose जेल (चित्र 2) द्वारा।

PCR एक अति संवेदनशील विधि हो र एकल प्रतिक्रियाहरूको लागि धेरै सानो मात्रा आवश्यक छ, धेरै प्रतिक्रियाहरूको लागि मास्टर मिक्स तयार गर्न सिफारिस गरिन्छ।मास्टर मिक्स राम्रोसँग मिसाइएको हुनुपर्छ र त्यसपछि प्रतिक्रियाहरूको संख्याद्वारा विभाजित हुनुपर्छ, सुनिश्चित गर्नुहोस् कि प्रत्येक प्रतिक्रियामा इन्जाइम, dNTPs र प्राइमरहरूको समान मात्रा हुनेछ।Enzo Life Sciences जस्ता धेरै आपूर्तिकर्ताहरूले PCR मिक्सहरू पनि प्रस्ताव गर्छन् जसमा प्राइमर र DNA टेम्प्लेट बाहेक सबै कुरा समावेश छ।

Guanine/Cytosine-rich (GC-rich) क्षेत्रहरूले मानक PCR प्रविधिहरूमा चुनौती प्रतिनिधित्व गर्दछ।GC-रिच अनुक्रमहरू कम GC सामग्री भएका अनुक्रमहरू भन्दा बढी स्थिर छन्।यसबाहेक, GC-रिच अनुक्रमहरू माध्यमिक संरचनाहरू बनाउँछन्, जस्तै हेयरपिन लूपहरू।नतिजाको रूपमा, जीसी-रिच डबल स्ट्र्यान्डहरू विकृतीकरण चरणमा पूर्ण रूपमा अलग गर्न गाह्रो हुन्छ।फलस्वरूप, DNA पोलिमरेजले कुनै अवरोध बिना नयाँ स्ट्र्यान्डलाई संश्लेषण गर्न सक्दैन।उच्च विकृतिकरण तापमानले यसलाई सुधार गर्न सक्छ, र उच्च एनेलिङ तापक्रम र छोटो एनेलिङ समयको समायोजनले GC-रिच प्राइमरहरूको अविशिष्ट बन्धनलाई रोक्न सक्छ।अतिरिक्त अभिकर्मकहरूले GC-रिच अनुक्रमहरूको प्रवर्धन बढाउन सक्छ।DMSO, glycerol, र betaine ले GC अन्तरक्रियाको कारणले हुने माध्यमिक संरचनाहरूलाई बाधा पुर्‍याउन मद्दत गर्दछ र यसैले डबल स्ट्र्यान्डहरू छुट्याउन मद्दत गर्दछ।

हट स्टार्ट पीसीआर

अविशिष्ट प्रवर्धन एक समस्या हो जुन PCR को समयमा हुन सक्छ।PCR को लागि प्रयोग गरिने अधिकांश DNA पोलिमरेजहरू 68°C देखि 72°C सम्मको तापक्रममा राम्रो काम गर्दछ।इन्जाइम, तथापि, कम तापक्रममा पनि सक्रिय हुन सक्छ, यद्यपि कम डिग्रीमा।एनेलिङको तापक्रमभन्दा धेरै तलको तापक्रममा, प्राइमरहरूले गैर-विशेष रूपमा बाँध्न सक्छन् र प्रतिक्रियालाई बरफमा सेटअप गरिएको भए तापनि गैर-विशिष्ट प्रवर्द्धन गर्न सक्छ।यसलाई एक निश्चित तापक्रममा पुगेपछि मात्र DNA पोलिमरेजबाट अलग हुने पोलिमरेज इन्हिबिटरहरू प्रयोग गरेर यसलाई रोक्न सकिन्छ, त्यसैले हट स्टार्ट PCR शब्द भनिन्छ।अवरोधक एक एन्टिबडी हुन सक्छ जसले प्रारम्भिक विकृतीकरण तापमान (सामान्यतया 95 डिग्री सेल्सियस) मा पोलिमरेज र डेन्चरहरूलाई बाँध्छ।

उच्च फिडेलिटी पोलिमरेज

जबकि डीएनए पोलिमरेजहरू मूल टेम्प्लेट अनुक्रममा एकदम सही रूपमा विस्तार गर्दछ, न्यूक्लियोटाइड मिलानमा गल्तीहरू हुन सक्छ।क्लोनिङ जस्ता एप्लिकेसनहरूमा बेमेलको परिणामले काटिएको ट्रान्सक्रिप्टहरू, र गलत अनुवादित वा निष्क्रिय प्रोटीनहरू डाउनस्ट्रीम हुन सक्छ।यी बेमेलहरूबाट बच्नको लागि, "प्रूफरीडिङ" गतिविधिको साथ पोलिमरेजहरू पहिचान गरी कार्यप्रवाहमा समावेश गरिएको छ।पहिलो प्रूफरीडिङ पोलिमरेज, Pfu, 1991 मा Pyrococcus furiosus मा पहिचान गरिएको थियो।यो Pfu इन्जाइमको 3' देखि 5' exonuclease गतिविधि छ।जसरी डीएनए प्रवर्धित हुन्छ, एक्सोन्युक्लिजले स्ट्र्यान्डको 3' अन्त्यमा बेमेल न्यूक्लियोटाइडहरू हटाउँछ।त्यसपछि सही न्यूक्लियोटाइड प्रतिस्थापित हुन्छ, र डीएनए संश्लेषण जारी रहन्छ।गलत न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमहरूको पहिचान इन्जाइमको साथ सही न्यूक्लियोसाइड ट्राइफोस्फेटको लागि बाध्यकारी सम्बन्धमा आधारित छ, जहाँ अकुशल बन्धनले संश्लेषणलाई सुस्त बनाउँछ र सही प्रतिस्थापनको लागि अनुमति दिन्छ।Pfu पोलिमरेजको प्रूफरीडिङ गतिविधिले Taq DNA पोलिमरेजको तुलनामा अन्तिम अनुक्रममा कम त्रुटिहरू निम्त्याउँछ।हालैका वर्षहरूमा, अन्य प्रूफरीडिङ इन्जाइमहरू पहिचान गरिएको छ, र DNA प्रवर्धनको क्रममा त्रुटि दरलाई कम गर्न मूल Pfu इन्जाइमको परिमार्जन गरिएको छ।

RT-PCR

रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन PCR, वा RT-PCR, टेम्प्लेटको रूपमा RNA को प्रयोग गर्न अनुमति दिन्छ।थप कदमले आरएनए पत्ता लगाउन र प्रवर्धन गर्न अनुमति दिन्छ।RNA लाई रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेस प्रयोग गरेर पूरक DNA (cDNA) मा उल्टो ट्रान्सक्रिप्ट गरिएको छ।आरएनए टेम्प्लेटको गुणस्तर र शुद्धता RT-PCR को सफलताको लागि आवश्यक छ।RT-PCR को पहिलो चरण DNA/RNA हाइब्रिडको संश्लेषण हो।रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेजसँग पनि RNase H प्रकार्य छ, जसले हाइब्रिडको RNA भागलाई घटाउँछ।एकल-स्ट्र्यान्डेड डीएनए अणु त्यसपछि सीडीएनएमा रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेजको डीएनए-आश्रित डीएनए पोलिमरेज गतिविधिद्वारा पूरा हुन्छ।पहिलो-स्ट्र्यान्ड प्रतिक्रियाको दक्षताले प्रवर्धन प्रक्रियालाई असर गर्न सक्छ।यहाँ देखि, मानक PCR प्रक्रिया cDNA को विस्तार गर्न को लागी प्रयोग गरिन्छ।RT-PCR द्वारा RNA लाई cDNA मा फर्काउने सम्भावनाका धेरै फाइदाहरू छन्, र यो मुख्य रूपमा जीन अभिव्यक्ति विश्लेषणको लागि प्रयोग गरिन्छ।आरएनए एकल-स्ट्रेन्डेड र धेरै अस्थिर छ, जसले यसलाई काम गर्न चुनौतीपूर्ण बनाउँछ।यो सामान्यतया qPCR मा पहिलो चरणको रूपमा कार्य गर्दछ, जसले जैविक नमूनामा आरएनए ट्रान्सक्रिप्टहरू परिमाण गर्दछ।

qPCR र RT-qPCR

परिमाणात्मक PCR (qPCR) धेरै अनुप्रयोगहरूको लागि न्यूक्लिक एसिड पत्ता लगाउन, विशेषता र मात्रा निर्धारण गर्न प्रयोग गरिन्छ।RT-qPCR मा, RNA ट्रान्सक्रिप्टहरूलाई पहिले माथि वर्णन गरिएझैं तिनीहरूलाई उल्टो ट्रान्सक्रिप्ट गरेर cDNA मा परिमाण निर्धारण गरिन्छ, र त्यसपछि qPCR पछि गरिन्छ।मानक PCR मा जस्तै, DNA तीन दोहोरिने चरणहरू द्वारा विस्तारित हुन्छ: विकृतीकरण, एनिलिङ, र विस्तार।जे होस्, qPCR मा, फ्लोरोसेन्ट लेबलिंगले PCR प्रगतिको रूपमा डेटाको सङ्कलनलाई सक्षम बनाउँछ।यस प्रविधिमा उपलब्ध विधिहरू र रसायनशास्त्रहरूको दायराका कारण धेरै फाइदाहरू छन्।

डाई-आधारित क्यूपीसीआर (सामान्यतया हरियो) मा, फ्लोरोसेन्ट लेबलिंगले dsDNA बाइन्डिङ डाईको प्रयोग गरेर एम्प्लीफाइड डीएनए अणुहरूको परिमाणीकरण गर्न अनुमति दिन्छ।प्रत्येक चक्रको समयमा, प्रतिदीप्ति मापन गरिन्छ।प्रतिदीप्ति संकेत समानुपातिक रूपमा प्रतिकृति DNA को मात्रा बढ्छ।तसर्थ, DNA को "वास्तविक-समय" मा परिमाण गरिन्छ (चित्र 3)।डाई-आधारित क्यूपीसीआरका बेफाइदाहरू यो हो कि एक पटकमा एउटा मात्र लक्ष्य जाँच गर्न सकिन्छ र रङ नमूनामा उपस्थित कुनै पनि ds-DNA मा बाँध्नेछ।

प्रोब-आधारित qPCR मा, प्रत्येक नमूनामा धेरै लक्ष्यहरू एकै साथ पत्ता लगाउन सकिन्छ, तर यसका लागि प्राइमरहरू बाहेक प्रयोग गरिएको लक्ष्य-विशिष्ट जाँच(हरू) को अनुकूलन र डिजाइन आवश्यक पर्दछ।धेरै प्रकारका प्रोब डिजाइनहरू उपलब्ध छन्, तर सबैभन्दा सामान्य प्रकार हाइड्रोलिसिस प्रोब हो, जसले फ्लोरोफोर र क्वेन्चर समावेश गर्दछ।फ्लोरोसेन्स अनुनाद ऊर्जा स्थानान्तरण (FRET) ले क्वेंचर मार्फत फ्लोरोफोरको उत्सर्जनलाई रोक्छ जबकि प्रोब अक्षुण्ण छ।जे होस्, PCR प्रतिक्रियाको समयमा, प्राइमर एक्सटेन्सन र यो बाध्य भएको विशिष्ट अनुक्रमको प्रवर्धनको क्रममा प्रोबलाई हाइड्रोलाइज गरिन्छ।प्रोबको क्लीभेजले फ्लोरोफोरलाई क्वेन्चरबाट अलग गर्छ र फ्लोरोसेन्समा प्रवर्द्धन-निर्भर वृद्धिको परिणाम दिन्छ (चित्र 4)।तसर्थ, प्रोब-आधारित qPCR प्रतिक्रियाबाट फ्लोरोसेन्स संकेत नमूनामा उपस्थित प्रोब लक्ष्य अनुक्रमको मात्रासँग समानुपातिक हुन्छ।किनकी प्रोब-आधारित qPCR डाई-आधारित qPCR भन्दा बढी विशिष्ट छ, यो प्राय: qPCR-आधारित डायग्नोस्टिक एसेसहरूमा प्रयोग हुने प्रविधि हो।

Isothermal प्रवर्धन

माथि उल्लिखित PCR प्रविधिहरूलाई महँगो थर्मोसाइक्लिङ उपकरणहरू चाहिन्छ जुन चेम्बरको तापक्रमलाई सही रूपमा र्‍याम्प अप र डाउन डिनेच्युरेसन, एनिलिङ, र विस्तार चरणहरूका लागि।धेरै प्रविधिहरू विकसित गरिएका छन् जसलाई त्यस्ता सटीक उपकरणहरू आवश्यक पर्दैन र साधारण पानीको नुहाउने वा रुचिको कक्षहरूमा पनि प्रदर्शन गर्न सकिन्छ।यी प्रविधिहरूलाई सामूहिक रूपमा आइसोथर्मल एम्प्लीफिकेशन भनिन्छ र घातीय, रैखिक, वा क्यास्केड प्रवर्धनमा आधारित काम गर्दछ।

आइसोथर्मल एम्प्लीफिकेशनको सबैभन्दा प्रसिद्ध प्रकार लूप-मध्यस्थ आइसोथर्मल प्रवर्धन, वा LAMP हो।LAMP ले टेम्प्लेट DNA वा RNA लाई विस्तार गर्न 65⁰C मा घातीय प्रवर्धन प्रयोग गर्दछ।LAMP प्रदर्शन गर्दा, लक्ष्य DNA को क्षेत्रहरूमा पूरक चार देखि छ प्राइमरहरू नयाँ DNA संश्लेषण गर्न DNA पोलिमरेजको साथ प्रयोग गरिन्छ।यी मध्ये दुई प्राइमरहरूमा मानार्थ अनुक्रमहरू छन् जसले अन्य प्राइमरहरूमा अनुक्रमहरू पहिचान गर्दछ र तिनीहरूलाई बाँध्छ, नयाँ संश्लेषित DNA मा "लूप" संरचना बनाउनको लागि अनुमति दिन्छ जसले त्यसपछि एम्प्लीफिकेशनको पछिल्लो राउन्डहरूमा प्राइमर एनिलिङलाई मद्दत गर्दछ।LAMP लाई प्रतिदीप्ति, agarose जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस, वा colorimetry सहित धेरै विधिहरू द्वारा कल्पना गर्न सकिन्छ।कोलोरिमेट्री द्वारा उत्पादनको उपस्थिति वा अनुपस्थितिलाई भिजुअलाइज गर्न र पत्ता लगाउने सजिलो र महँगो उपकरणको अभावले LAMP लाई SARS-CoV-2 परीक्षणको लागि उपयुक्त विकल्प बनायो जहाँ क्लिनिकल ल्याब परीक्षण सजिलै उपलब्ध थिएन, वा नमूनाहरूको भण्डारण र ढुवानी। सम्भव थिएन, वा प्रयोगशालाहरूमा जुन पहिले पीसीआर थर्मोसाइक्लिंग उपकरणहरू थिएनन्।