प्रारम्भिक सामग्री: आरएनए
क्वान्टिटेटिभ रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन PCR (RT-qPCR) प्रारम्भिक सामग्रीको रूपमा आरएनए प्रयोग गरेर PCR प्रयोगहरूमा प्रयोग गरिने एक प्रयोगात्मक विधि हो।यस विधिमा, कुल आरएनए वा मेसेन्जर आरएनए (mRNA) लाई पहिले रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेजद्वारा पूरक DNA (cDNA) मा ट्रान्सक्रिप्ट गरिन्छ।पछि, टेम्प्लेटको रूपमा cDNA प्रयोग गरेर qPCR प्रतिक्रिया प्रदर्शन गरिएको थियो।RT-qPCR जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण, आरएनए हस्तक्षेप प्रमाणीकरण, माइक्रोएरे प्रमाणीकरण, रोगजनक पत्ता लगाउने, आनुवंशिक परीक्षण, र रोग अनुसन्धान सहित विभिन्न आणविक जीवविज्ञान अनुप्रयोगहरूमा प्रयोग गरिएको छ।
RT-qPCR को लागि एक-चरण र दुई-चरण विधिहरू
RT-qPCR एक-चरण वा दुई-चरण विधि द्वारा पूरा गर्न सकिन्छ।एक-चरण RT-qPCR ले रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन र PCR एम्प्लीफिकेशनलाई संयोजन गर्दछ, रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेज र DNA पोलिमरेजलाई एउटै बफर अवस्थाहरूमा एउटै ट्यूबमा प्रतिक्रिया पूरा गर्न अनुमति दिन्छ।एक-चरण RT-qPCR लाई केवल अनुक्रम-विशिष्ट प्राइमरहरूको प्रयोग आवश्यक छ।दुई-चरण RT-qPCR मा, रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन र PCR एम्प्लीफिकेशन दुई ट्यूबहरूमा प्रदर्शन गरिन्छ, विभिन्न अनुकूलित बफरहरू, प्रतिक्रिया अवस्थाहरू, र प्राइमर डिजाइन रणनीतिहरू प्रयोग गरेर।
| फाइदा | बेफाइदा | |
| एक कदम | यो विधिमा कम प्रयोगात्मक त्रुटि छ किनकि दुबै प्रतिक्रियाहरू एउटै ट्यूबमा गरिन्छ
थोरै पाइपिङ चरणहरूले प्रदूषणको जोखिम कम गर्छ
उच्च-थ्रुपुट एम्प्लीफिकेशन/स्क्रिनिङका लागि उपयुक्त, छिटो र पुन: उत्पादन गर्न सकिने | दुई-चरण प्रतिक्रियाहरू अलग रूपमा अनुकूलित गर्न सकिँदैन
प्रतिक्रिया अवस्थाहरू दुई-चरण प्रतिक्रिया संयोजन गरेर सम्झौता गरिएको हुनाले, संवेदनशीलता दुई-चरण विधिको रूपमा राम्रो छैन।
एकल नमूना द्वारा पत्ता लगाइएको लक्ष्यहरूको संख्या सानो छ |
| दुई पाइला | स्थिर cDNA पुस्तकालयहरू सिर्जना गर्ने क्षमता जुन लामो समयको लागि भण्डारण गर्न सकिन्छ र धेरै प्रतिक्रियाहरूमा प्रयोग गर्न सकिन्छ।
लक्षित जीन र सन्दर्भ जीनहरू एउटै सीडीएनए पुस्तकालयबाट धेरै सीडीएनए पुस्तकालयहरूको आवश्यकता बिना नै विस्तार गर्न सकिन्छ।
प्रतिक्रिया बफरहरू र प्रतिक्रिया अवस्थाहरू जसले एकल प्रतिक्रिया रनहरूको अनुकूलन सक्षम गर्दछ
ट्रिगर अवस्थाहरूको लचिलो चयन | धेरै ट्यूबहरू प्रयोग गरेर, र थप पाइपिङ चरणहरूले DNA प्रदूषणको जोखिम बढाउँछ, र समय खपत।
एक-चरण विधि भन्दा बढी अनुकूलन आवश्यक छ |
सम्बन्धित उत्पादनहरु:
RT-qPCR Easyᵀᴹ (एक चरण)-SYBR ग्रीन I
RT-qPCR Easyᵀᴹ (एक चरण) - Taqman
RT Easyᵀᴹ I Master Premix for First-Strand CDNA संश्लेषण
वास्तविक समय PCR Easyᵀᴹ-SYBR ग्रीन I किट
वास्तविक समय PCR Easyᵀᴹ-Takman
कुल RNA र mRNA को चयन
RT-qPCR प्रयोग डिजाइन गर्दा, कुल RNA वा शुद्ध mRNA लाई रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शनको लागि टेम्प्लेटको रूपमा प्रयोग गर्ने कि नगर्ने निर्णय गर्न महत्त्वपूर्ण छ।यद्यपि mRNA ले थोरै उच्च संवेदनशीलता प्रदान गर्न सक्षम हुन सक्छ, कुल RNA अझै पनि बारम्बार प्रयोग गरिन्छ।यसको कारण यो हो कि कुल आरएनएको एमआरएनए भन्दा प्रारम्भिक सामग्रीको रूपमा बढी महत्त्वपूर्ण फाइदा छ।पहिलो, प्रक्रियालाई कम शुद्धिकरण चरणहरू चाहिन्छ, जसले टेम्प्लेटको राम्रो मात्रात्मक रिकभरी र सेल नम्बरहरू सुरु गर्न परिणामहरूको राम्रो सामान्यीकरण सुनिश्चित गर्दछ।दोस्रो, यसले mRNA संवर्द्धन चरणलाई बेवास्ता गर्छ, जसले विभिन्न mRNA को विभिन्न रिकभरीहरूको कारण स्क्युड नतिजाहरूको सम्भावनाबाट बच्न सक्छ।समग्रमा, धेरै जसो अनुप्रयोगहरूमा लक्षित जीनको सापेक्ष परिमाण पत्ता लगाउने पूर्ण संवेदनशीलता भन्दा बढी महत्त्वपूर्ण छ, कुल आरएनए धेरै जसो केसहरूमा बढी उपयुक्त हुन्छ।
उल्टो ट्रान्सक्रिप्शन प्राइमर
दुई-चरण विधिमा, सीडीएनए प्रतिक्रियालाई प्राइम गर्न तीन फरक तरिकाहरू प्रयोग गर्न सकिन्छ: ओलिगो(डीटी) प्राइमरहरू, अनियमित प्राइमरहरू, वा अनुक्रम-विशिष्ट प्राइमरहरू।सामान्यतया, ओलिगो (डीटी) प्राइमरहरू र अनियमित प्राइमरहरू संयोजनमा प्रयोग गरिन्छ।यी प्राइमरहरूले टेम्प्लेट mRNA स्ट्र्यान्डमा एनिल गर्दछ र संश्लेषणको लागि सुरूवात बिन्दुको साथ रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेस प्रदान गर्दछ।
| प्राइमर चयन | संरचना र कार्य | फाइदा | बेफाइदा |
| ओलिगो (डीटी) प्राइमर (वा एन्कर गरिएको ओलिगो (डीटी) प्राइमर) | mRNA को पोली(A) पुच्छरमा थाइमाइन अवशेषहरूमा विस्तारित एनिलिङ;एंकर ओलिगो(dT) प्राइमरमा 3′ अन्तमा G, C, वा A समावेश हुन्छ (एंकर साइट) | Poly(A)-टेल्ड mRNA बाट पूर्ण-लम्बाइ cDNA को संश्लेषण
कम सुरु हुने सामग्री उपलब्ध हुँदा लागू हुन्छ
एङ्करिङ साइटले ओलिगो(डीटी) प्राइमर mRNA को 5′ पोली(A) पुच्छरसँग जोडिएको कुरा सुनिश्चित गर्दछ। | पोली(ए) पुच्छरहरू भएका जीनहरू विस्तार गर्नका लागि मात्र उपयुक्त
प्राइमिङ साइटबाट काटिएको cDNA प्राप्त गर्नुहोस्*2 पोली(A) मा
3′ अन्त्यमा बाँध्न पक्षपाती*
*एङ्कर गरिएको ओलिगो(डीटी) प्राइमरहरू प्रयोग गरिएमा यो सम्भावना कम हुन्छ |
| अनियमित प्राइमर
| लम्बाइमा 6 देखि 9 आधारहरू, जसले RNA ट्रान्सक्रिप्शनको समयमा धेरै साइटहरूमा एनिल गर्न सक्छ | सबै RNAs (tRNA, rRNA, र mRNA) लाई एनिल गर्नुहोस्
महत्त्वपूर्ण माध्यमिक संरचना भएका ट्रान्सक्रिप्टहरूको लागि उपयुक्त, वा कम सुरु हुने सामग्री उपलब्ध हुँदा
उच्च सीडीएनए उपज | cDNA सबै आरएनएबाट उल्टो ट्रान्सक्राइब गरिएको छ, जुन सामान्यतया चाहिँदैन र लक्ष्य mRNA को संकेतलाई कमजोर गर्न सक्छ।
काटिएको cDNA पाउनुहोस् |
| अनुक्रम-विशिष्ट प्राइमरहरू | विशेष mRNA अनुक्रमहरू लक्षित कस्टम प्राइमरहरू | विशिष्ट cDNA पुस्तकालय
संवेदनशीलता सुधार गर्नुहोस्
रिभर्स qPCR प्राइमरहरू प्रयोग गर्दै | केवल एकल लक्ष्य जीनको संश्लेषणमा सीमित |
उल्टो ट्रान्सक्रिप्टेस
रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेज एक इन्जाइम हो जसले डीएनए संश्लेषण गर्न आरएनए प्रयोग गर्दछ।केहि रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेसहरूमा RNase गतिविधि हुन्छ र ट्रान्सक्रिप्शन पछि RNA-DNA हाइब्रिड स्ट्र्यान्डहरूमा RNA स्ट्र्यान्डहरू घटाउन सक्छ।यदि यसमा RNase enzymatic गतिविधि छैन भने, RNaseH उच्च qPCR दक्षताको लागि थप्न सकिन्छ।सामान्यतया प्रयोग हुने इन्जाइमहरूमा मोलोनी मुरिन ल्युकेमिया भाइरस रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेज र एभियन माइलोब्लास्टोमा भाइरस रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेज समावेश छ।RT-qPCR को लागि, उच्च थर्मोस्टेबिलिटी भएको रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेस छनोट गर्नु उपयुक्त हुन्छ, ताकि उच्च तापक्रममा cDNA संश्लेषण गर्न सकिन्छ, उच्च माध्यमिक संरचना भएका RNAs को सफल ट्रान्सक्रिप्सन सुनिश्चित गर्दै, प्रतिक्रियाभर तिनीहरूको पूर्ण गतिविधि कायम राख्दै, उच्च cDNA उपजको परिणामस्वरूप।
सम्बन्धित उत्पादनहरु:
Foreasy M-MLV रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेज
रिवर्स ट्रान्सक्रिप्टेजको RNase H गतिविधि
RNaseH RNA-DNA डुप्लेक्सहरूबाट RNA strands लाई घटाउन सक्षम छ, जसले डबल-स्ट्र्यान्ड DNA को कुशल संश्लेषणलाई अनुमति दिन्छ।जे होस्, लामो mRNA लाई टेम्प्लेटको रूपमा प्रयोग गर्दा, RNA समयभन्दा पहिले नै घट्न सक्छ, जसको परिणामस्वरूप cDNA काटिएको हुन्छ।तसर्थ, लामो ट्रान्सक्रिप्टहरूको संश्लेषण चाहिन्छ भने cDNA क्लोनिङको समयमा RNaseH गतिविधिलाई कम गर्न अक्सर लाभदायक हुन्छ।यसको विपरित, RNase H गतिविधिका साथ रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेसहरू प्रायः qPCR अनुप्रयोगहरूको लागि लाभदायक हुन्छन् किनभने तिनीहरूले PCR को पहिलो चक्रको समयमा RNA-DNA डुप्लेक्सहरू पग्लन बढाउँछन्।
प्राइमर डिजाइन
RT-qPCR मा qPCR चरणको लागि प्रयोग गरिएको PCR प्राइमरहरू आदर्श रूपमा एक्सोन-एक्सोन जंक्शन फैलाउनको लागि डिजाइन गरिएको हुनुपर्छ, जहाँ एम्प्लीफिकेशन प्राइमरले सम्भावित रूपमा वास्तविक एक्सोन-इन्ट्रोन सीमा फैलाउन सक्छ।इन्ट्रोन युक्त जीनोमिक डीएनए अनुक्रमहरू एम्प्लिफाइड नभएकोले, यो डिजाइनले जीनोमिक डीएनए दूषित हुनबाट प्रवर्द्धित झूटा सकारात्मकहरूको जोखिम कम गर्छ।
यदि प्राइमरहरू एक्सोन वा एक्सोन-एक्सोन सीमाहरू अलग गर्न डिजाइन गर्न सकिँदैन भने, जीनोमिक DNA प्रदूषण हटाउन RNase-रहित DNase I वा dsDNase सँग RNA नमूनाहरू उपचार गर्न आवश्यक हुन सक्छ।
RT-qPCR नियन्त्रण
एक रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन नकारात्मक नियन्त्रण (-RT नियन्त्रण) सबै RT-qPCR प्रयोगहरूमा DNA प्रदूषण (जस्तै अघिल्लो प्रतिक्रियाहरूबाट जीनोमिक DNA वा PCR उत्पादनहरू) पत्ता लगाउन समावेश गर्नुपर्छ।यो नियन्त्रणले रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेज बाहेक सबै प्रतिक्रिया कम्पोनेन्टहरू समावेश गर्दछ।यस नियन्त्रणको साथ रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन नहुने हुनाले, यदि PCR एम्प्लीफिकेशन अवलोकन गरिन्छ भने, DNA बाट दूषित हुने सम्भावना बढी हुन्छ।
पोस्ट समय: अगस्ट-02-2022
