1. RNA समाधानको अवशोषण पत्ता लगाउनुहोस्
280, 320, 230, र 260 nm मा अवशोषणले क्रमशः न्यूक्लिक एसिड, पृष्ठभूमि (समाधान टर्बिडिटी), नुन एकाग्रता, र प्रोटिन जस्ता जैविक पदार्थको मानहरू प्रतिनिधित्व गर्दछ।सामान्यतया OD260/OD280 (अनुपात, R) मा मात्र हेर्नुहोस्।जब 1.8 ~ 2.0, हामी RNA मा प्रोटिन वा अन्य जैविक पदार्थको प्रदूषण सहन सक्छ भन्ने सोच्दछौं, तर यो ध्यान दिनुपर्छ कि जब Tris अवशोषण पत्ता लगाउन बफरको रूपमा प्रयोग गरिन्छ, R मान 2 भन्दा बढी हुन सक्छ (सामान्यतया यो <2.2 हुनुपर्छ)।जब R <1.8, समाधानमा प्रोटीन वा अन्य जैविक पदार्थको प्रदूषण अधिक स्पष्ट हुन्छ, र RNA को भाग्य आवश्यकता अनुसार निर्धारण गर्न सकिन्छ।जब R> 2.2, यसको मतलब RNA एकल न्यूक्लिक एसिडमा हाइड्रोलाइज गरिएको छ।
2. RNA को इलेक्ट्रोफोरेटिक ढाँचा
सामान्यतया, आरएनए इलेक्ट्रोफोरेसिसको लागि डिनेचरिंग जेल प्रयोग गरिन्छ, तर यदि यो केवल आरएनएको गुणस्तर पत्ता लगाउनको लागि हो भने, डिनेचरिंग जेल आवश्यक छैन, र साधारण एगारोज जेल प्रयोग गर्न सकिन्छ।इलेक्ट्रोफोरेसिसको उद्देश्य 28S र 18S ब्यान्डहरूको अखण्डता र तिनीहरूको अनुपात, वा mRNA स्मियरको अखण्डता पत्ता लगाउनु हो।सामान्यतया, यदि 28S र 18S ब्यान्डहरू उज्यालो, स्पष्ट, र तीखो छन् (ब्यान्डको किनारहरू स्पष्ट छन्) र 28S को चमक 18S ब्यान्डको भन्दा दोब्बर भन्दा बढी छ भने, हामी RNA को गुणस्तर राम्रो मान्दछौं।
माथिका दुई विधिहरू हुन् जुन हामीले सामान्यतया प्रयोग गर्छौं, तर यी दुई विधिहरूमध्ये कुनै पनि RNA समाधानमा अवशिष्ट RNase छ कि छैन भनेर स्पष्ट रूपमा बताउन सक्दैन।यदि समाधानमा धेरै थोरै मात्रामा RNase छ भने, हामीलाई माथिको विधिबाट पत्ता लगाउन गाह्रो हुन्छ, तर त्यसपछिका अधिकांश इन्जाइम्याटिक प्रतिक्रियाहरू 37 डिग्री भन्दा माथि र लामो समयसम्म गरिन्छ।यसरी, यदि आरएनए समाधानमा धेरै थोरै मात्रामा RNase छ भने, त्यसपछिको प्रयोगहरूमा उनीहरूको भूमिका खेल्नको लागि एकदम उपयुक्त वातावरण र समय हुनेछ, र पक्कै पनि यस समयमा प्रयोग चिसो हुनेछ।तल हामी RNA समाधानमा अवशिष्ट RNase छ कि छैन भनेर पुष्टि गर्न सक्ने विधि प्रस्तुत गर्दछौं।
3. गर्मी संरक्षण परीक्षण
नमूना सांद्रता अनुसार, RNA समाधानबाट दुई 1000 ng RNA कोर्नुहोस् र यसलाई 0.5 ml सेन्ट्रीफ्यूज ट्यूबमा थप्नुहोस्, र pH 7.0 Tris बफरसँग 10 ul को कुल मात्रामा पूरक गर्नुहोस्, र त्यसपछि ट्यूबको क्याप सील गर्नुहोस्।ती मध्ये एउटालाई ७० डिग्री सेल्सियसमा स्थिर तापक्रमको पानीको बाथमा राख्नुहोस् र यसलाई १ घन्टाको लागि न्यानो राख्नुहोस्।अर्को भाग -20 डिग्री सेल्सियस फ्रिजमा 1 घण्टाको लागि भण्डारण गरिएको थियो।जब समय सकियो, इलेक्ट्रोफोरेसिसको लागि दुई नमूनाहरू हटाउनुहोस्।इलेक्ट्रोफोरेसिस पूरा भएपछि, दुईको इलेक्ट्रोफोरेटिक ब्यान्डहरू तुलना गर्नुहोस्।यदि दुईको ब्यान्डहरू एकरूप छन् वा कुनै महत्त्वपूर्ण भिन्नता छैन (निस्सन्देह, तिनीहरूको ब्यान्डले विधि 2 मा सर्तहरू पूरा गर्दछ), यसको मतलब RNA समाधानमा कुनै अवशिष्ट RNase प्रदूषण छैन, र RNA को गुणस्तर धेरै राम्रो छ।यसको विपरित, यदि 70 डिग्री सेल्सियसमा इन्क्युबेटेड नमूनाले स्पष्ट गिरावट देखाउँछ भने, यसले आरएनए घोलमा RNase प्रदुषण भएको संकेत गर्दछ।
२ आरएनए निकासीका लागि प्रयोगात्मक विधि र प्रविधिहरू
आरएनए निकाल्दा हामीले अक्सर सामना गर्ने समस्याहरू निम्न हुन्: (१) आरएनए उपज कम छ;(२) आरएनएमा गम्भीर नुन प्रदूषण छ;(३) आरएनएमा गम्भीर जैविक विलायक प्रदूषण छ;(4) नमूना गिरावट र अन्य समस्याहरू
1. सामान्यतया प्रयोग हुने कुल आरएनए निकासी अभिकर्मकहरू
guanidine isothiocyanate विधि र Trizol विधि जनावरको तन्तु र जनावरको कोशिकाहरूबाट कुल आरएनए निकासीका लागि सबैभन्दा बढी प्रयोग हुने विधिहरू हुन्।यो विशेष गरी साना नमूनाहरू र तन्तुहरूको लागि उपयुक्त छ जुन निकाल्न विशेष गरी गाह्रो हुन्छ, जस्तै खरगोशको छाला र जनावरको संयोजी ऊतकबाट कुल आरएनए निकासी;थप रूपमा, Trizol, एक सामान्य-उद्देश्य lysis अभिकर्मक रूपमा, पनि बिरुवाको तन्तु, ब्याक्टेरिया, कवक र अन्य तन्तुहरूको निकासीको लागि प्रयोग गर्न सकिन्छ।क्यामेलिया ओलिफेरा, चिया पात, रेपसीड आदि जस्ता पोलिसेकराइड र पोलिफेनोल युक्त बिरुवाको तन्तुका लागि CTAB विधि कुल आरएनए निकाल्न पनि प्रयोग गर्न सकिन्छ।
परम्परागत विधिको रूपमा, डबल-स्तम्भ विधि यसको सामान्य तापमान सञ्चालनको कारणले पनि धेरै लोकप्रिय छ, RNase थप्न आवश्यक छैन, र सुरक्षा - कुनै क्लोरोफर्म, फिनोलहरू र अन्य जैविक अभिकर्मकहरू निकासीको लागि।(सिफारिस गरिएका उत्पादनहरू )
2. जनावरको तन्तुबाट कुल आरएनए निकासी
(१) ताजा टिस्यु छनोट गर्ने प्रयास गर्नुहोस्, यदि यो ताजा छैन भने (अधिमानतः तीन महिना भित्र - 80 ℃ फ्रिज वा तरल नाइट्रोजनमा जमेको। टिस्यु काट्दा, कोठाको तापक्रममा सीधै न काट्नुहोस्, यसलाई आइस बक्समा राख्न निश्चित हुनुहोस्, बारम्बार चिसो र पग्लनबाट जोगिन प्रयास गर्नुहोस्।
(२) टिस्युको सानो टुक्रा काट्न सफा कैंची र चिमटी प्रयोग गर्नुहोस्, नमूना काट्दा टिस्युको मध्य भाग काट्ने प्रयास गर्नुहोस्, वा पहिले तन्तुको ठूलो टुक्रालाई बीचबाट काट्नुहोस्, र त्यसपछि ताजा चीरा स्थितिमा नमूना काट्नुहोस्।हटाइएका टिस्युलाई पूर्ण रूपमा टुक्रा पार्नु पर्छ, टुक्रा टुक्रा भएको टिस्युलाई RNase बिना EP ट्यूबमा राख्नुहोस्, लाइसेट थप्नुहोस्, टुक्रा टुक्रा टिस्यु पूर्ण रूपमा lysate मा खुला हुनुपर्छ, र एकरूपताको लागि तयारी गर्नुहोस्।
(३) सामान्य तन्तुहरूका लागि, एकरूपताका लागि मुगको दाना आकारका तन्तुहरू (३०-६० मिलीग्राम) चयन गर्नुहोस्।यदि तन्तुहरूमा ठूलो मात्रामा प्रोटिन, बोसो वा कलेजो जस्ता घना रेशायुक्त तन्तुहरू छन् भने, काटिएका तन्तुहरूको मात्रा उचित रूपमा बढाउनुहोस् वा घटाउनुहोस् (वैकल्पिक) 10 ~ 20 मिलीग्राम छान्नुहोस्)।
(४) यदि माछाको मांसपेशी, झिंगाको मासु, जेलीफिस र उच्च पानीको मात्रा भएका अन्य तन्तुहरू निकालिन्छ भने, नमूनाको मात्रा उचित रूपमा बढाउनुपर्छ (सिफारिस गरिएको १००-२०० मिलीग्राम)।
(५) यदि परिस्थितिले अनुमति दिन्छ भने, यदि त्यस्तो उपकरण नभएको खण्डमा उच्च-प्यासेज टिस्यु होमोजेनाइजरको साथ एकरूपता पछि जनावरको तन्तुलाई सीधै निकाल्न सकिन्छ।
(६) अन्तिम निकासी पछि प्राप्त आरएनए आरएनए को ह्रास कम गर्न तुरुन्तै बर्फ बक्स मा राख्नुपर्छ।
3. पशु सेल आरएनए निकासी
(१) निलम्बन कक्षहरू: सीधा सेन्ट्रीफ्यूज गर्नुहोस् र माध्यमलाई खारेज गर्नुहोस्, 1-2 पटक बाँझरहित PBS ले धुनुहोस्, त्यसपछि PBS को उपयुक्त मात्रामा निलम्बन गर्नुहोस्, र त्यसपछि lysis को लागि lysate थप्नुहोस्।तरल पदार्थलाई पूर्ण रूपमा खारेज गरिसकेपछि लाइसेटलाई सिधै प्रक्षेपित कक्षहरूमा थप नगर्नुहोस्।यसले हिस्टोन प्याकेजलाई बाहिरी तहमा लाइसेड सेलहरू पछि प्रक्षेपित कक्षहरूको बाहिरी भागमा पछ्याउनको लागि जारी गर्दछ, जसले गर्दा लाइसेटसँग गोली भित्र कोशिकाहरूको सम्पर्क सीमित हुन्छ।, अपूर्ण सेल lysis र कम RNA उपज को परिणामस्वरूप।
(२) कोशिकाहरू जुन अर्ध-अनुशासित छन् वा कडा रूपमा पालना गर्दैनन्: माध्यम खारेज गरिसकेपछि, PBS ले १-२ पटक धुनुहोस्, त्यसपछि सीधा पीबीएसको उचित मात्रा सोस्नुहोस् र कोशिकाहरू उडाउनको लागि पिपेट वा बन्दुकले कल्चर डिश उडाउनुहोस्, र तिनीहरूलाई RNA-मुक्त कक्षहरूमा स्थानान्तरण गर्नुहोस्।निकासीको लागि इन्जाइमको EP ट्यूबमा lysate थप्नुहोस्।
(३) अनुशासित कोशिकाहरू: पहिले ट्रिप्सिनसँग पचाउन आवश्यक छ, त्यसपछि RNase-रहित EP ट्युबहरूमा जम्मा गरिनु पर्छ, सुपरनेटेन्ट हटाउन सेन्ट्रीफ्यूज गरिएको छ, थप ट्रिप्सिन हटाउन PBS ले 1-2 पटक धुनु पर्छ, र PBS को उपयुक्त मात्राको साथ पुन: निकासी गर्ने चरणमा जानुहोस्।
4. बिरुवा आरएनए निकासी
बिरुवाका तन्तुहरू फेनोलिक यौगिकहरूमा धनी हुन्छन्, वा पोलिसेकराइडहरूमा धनी हुन्छन्, वा केही अज्ञात माध्यमिक मेटाबोलाइटहरू हुन्छन्, वा RNase को उच्च गतिविधि हुन्छ।यी पदार्थहरू सेल लाइसिस पछि RNA सँग जोडिएर अघुलनशील कम्प्लेक्स वा कोलोइडल प्रिसिपिटेटहरू बनाइन्छ, जुन हटाउन गाह्रो हुन्छ।त्यसकारण, जब हामी बिरुवाको तन्तु निकाल्छौं, हामीले बिरुवाहरूको लागि एउटा किट छान्नु पर्छ।किटमा रहेको लाइसेटले पोलिफेनोलको सजिलो अक्सिडेशन र पोलिसेकराइड यौगिकहरू र न्यूक्लिक एसिडको विभाजनको समस्यालाई प्रभावकारी रूपमा समाधान गर्न सक्छ।
(पोलिसेकराइड पोलिफेनोल प्लान्ट आरएनए निकासीको लागि, सिफारिस गरिएका उत्पादनहरू:
(१) बिरुवाको बोक्रा, पल्प, बीउ, पात आदिलाई मोर्टारमा पूरै भुइँमा राख्नुपर्छ।पीस्ने प्रक्रियाको बखत, तरल नाइट्रोजन नमूना पग्लनबाट बच्नको लागि समयमा भर्नुपर्छ।जमिनको नमूनालाई लाइसेटमा तुरुन्तै थपिनुपर्छ र RNA को ह्रासबाट बच्न हल्लाउनु पर्छ।
(२) फाइबर युक्त नमूनाहरू जस्तै चामल र गहुँको पातहरूका लागि, निकासीको मात्रा उचित रूपमा घटाउनुपर्छ, अन्यथा टिस्यु ग्राइन्डिङ र लिसिस पूरा हुने छैन, जसले गर्दा निकालिएको आरएनएको कम उत्पादन हुन्छ।
(३) अनारको फल, तरबूजको फल, आरुको फल, आदि जस्ता उच्च पानीको मात्रा भएका बिरुवाका तन्तुहरूको लागि, नमूनाको आकार उचित रूपमा बढाउनुपर्छ (100-200 मिलीग्राम वैकल्पिक छ)।
(4) बिरुवाका तन्तुहरू, जस्तै बिरुवाका पातहरू, rhizomes, कडा फलहरू र अन्य सामग्रीहरूलाई सामान्यतया तरल नाइट्रोजन प्रयोग गर्न सिफारिस गरिन्छ कि एक मोर्टारमा सामग्रीहरू राम्ररी मोर्टार गर्न, र त्यसपछि निकासी चरणमा जानुहोस्।परम्परागत टिश्यु होमोजेनाइजरहरू बिरुवाको तन्तुहरूलाई एकरूप बनाउन प्रभावकारी नहुन सक्छ, र सामान्यतया सिफारिस गरिँदैन।
5. आरएनए निकासीका लागि सावधानीहरू
(१) बारम्बार चिसो र पग्लिनबाट बच्न टिस्यु नमूनाहरू सकेसम्म ताजा हुनुपर्छ।
(२) निकासीको समयमा टिस्यु पूर्णतया भुइँमा हुनुपर्छ, र टिस्युको मात्रा धेरै कम हुनु हुँदैन, धेरै छोड्नुहोस्।
(३) नमूनालाई पूर्ण रूपमा लिज गर्न लाइसेट थपेपछि पर्याप्त इन्क्युबेशन समय दिनुपर्छ।
(4) निकासीको लागि Trizol विधि प्रयोग गर्दा, स्तरीकरण पछि supernatant अवशोषित को सिद्धान्त "अधिक सास फेर्नु भन्दा कम सास फेर्न मनपर्छ", र बीचको तहमा निकाल्नु हुँदैन, अन्यथा यसले गम्भीर जीनोमिक DNA प्रदूषण निम्त्याउँछ।
(५) धुँदा, धुने तरल पदार्थ नलीको पर्खालको वरिपरि पूर्ण रूपमा पस्नु पर्छ ताकि राम्ररी धुनुहोस्।
(६) स्तम्भ निकासी विधिको लागि, धुने पछि स्तम्भ अलग गर्नुका साथै, शोषण स्तम्भलाई अल्ट्रा-क्लीन बेन्चमा पनि राख्नुपर्छ र 5-10 मिनेटको लागि फ्याँक्नु पर्छ ताकि जैविक विलायकलाई पूर्ण रूपमा सुख्खा पार्नु होस्।
(७) स्तम्भ विधिको अन्तिम उत्सर्जनमा, DEPC पानी थपेपछि, यसलाई 3-5 मिनेटको लागि इन्क्युबेटेड गर्नुपर्छ, वा इल्युसन उत्पादन बढाउन DEPC पानीलाई 60 डिग्री सेल्सियसमा तताउनु पर्छ।परम्परागत Trizol क्लीभेज र isopropanol वर्षा विधिमा, अन्तिम RNA DEPC पानीमा घुलनशील हुन्छ, त्यसैले विघटनको लागि उपयुक्त समय दिनुपर्छ, र सेन्ट्रीफ्यूज ट्यूबको तल्लो भागलाई लगातार पिपेट टिपले उडाइरहनुपर्छ।
३ टिhree कम RNA एकाग्रता/खराब गुणस्तरको कारण र समाधानहरू
1. उपज धेरै कम छ
निकालिएको नमूना धेरै कम छ, कुल रकम अपर्याप्त छ, वा निकालिएको नमूना धेरै छ र lysis पूरा भएको छैन;निकासीको लागि उपयुक्त गुणस्तरको तन्तु वा कोशिकाहरू प्रयोग गर्नुपर्छ, नमूनाको पूर्व-उपचार राम्रोसँग गरिनुपर्छ, र लिसिस पर्याप्त हुनुपर्छ।
2. जीनोम अवशेषहरू
ट्रिजोल विधिद्वारा निकाल्दा, लेयरिङ पछि सुपरनेटेन्टलाई बीचको तहमा चुस्दा, गम्भीर जीनोम प्रदूषण हुनेछ;लेयरिङ गर्दा मध्य तहमा चुस्नबाट जोगिनको लागि अतिरिक्त सावधानी अपनाउनु पर्छ।यदि निकासीको लागि स्तम्भ विधि प्रयोग गरिन्छ भने, निकासीको लागि DNase I समावेश गरिएको किट चयन गर्न सकिन्छ।झिल्लीमा सोखिएको न्यूक्लिक एसिड सीधा DNase I सँग पचिन्छ, जसले DNA अवशेषहरूलाई धेरै कम गर्न सक्छ।
3. आरएनए गिरावट
यो निकासी गरिएको नमूनाको नै ह्रास हुन सक्छ, वा निकासी प्रक्रियाको क्रममा भएको ह्रास हुन सक्छ;जहाँसम्म सम्भव छ, ताजा नमूनाहरू आरएनए निकासीका लागि प्रयोग गर्नुपर्छ, र सङ्कलन गरिएका नमूनाहरूलाई तरल नाइट्रोजन वा -80 डिग्री सेल्सियस फ्रिजमा समयमै भण्डार गर्नुपर्छ, र बारम्बार चिसो र पग्लनबाट जोगिनुपर्छ।RNA निकासी प्रक्रियामा RNase/DNase फ्री टिप्स, सेन्ट्रीफ्यूज ट्यूब र अन्य सामग्रीहरू प्रयोग गर्नुपर्छ।निकासी प्रक्रिया सकेसम्म छिटो हुनुपर्छ।निकालिएको आरएनएलाई आइस बक्समा राख्नुपर्छ र समयमा -80 मा भण्डारण गर्नुपर्छ।यदि निकासी गरिएको आरएनए जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा पत्ता लगाउन आवश्यक छ भने, इलेक्ट्रोफोरेसिस निकासी पछि तुरुन्तै प्रदर्शन गरिनुपर्छ, र इलेक्ट्रोफोरेसिस बफरलाई नयाँ तयार पारिनु पर्छ।
4. नुन र जैविक विलायक अवशेषहरू
निकासी अभिकर्मकहरूमा फिनोल र गुआनिडाइन लवणहरू हुन्छन्, र धुने घोलमा इथानोल हुन्छ।निकासी प्रक्रियाको क्रममा, लाइसेट पूर्ण रूपमा अवशोषित र खारेज गरिएको थिएन, र धुने समाधान पूर्ण रूपमा सुकाइएको थिएन।अवशिष्ट लवण र जैविक विलायकहरू पछिको उल्टो ट्रान्सक्रिप्शन र PCR को लागी हानिकारक छन्।अवरोधका विभिन्न डिग्रीहरू, त्यसैले निकासी प्रक्रियाको क्रममा टिश्यू लाइसेट पूर्ण रूपमा हटाइनु पर्छ, र धुलाई पर्याप्त हुनुपर्छ ताकि ट्यूबको वरपरका पर्खालहरू धुन सकिन्छ।थप रूपमा, ट्यूब खाली गरिएको छ र उडाउनु आवश्यक कदम हो, जसले जैविक पदार्थको अवशेषलाई अझ कम गर्नेछ।
आरएनए निकासी बारे थप जानकारीको लागि, कृपया हाम्रो वेबसाइट पछ्याउनुहोस्:
थप जानकारीको लागि www.foreivd.com।
पोस्ट समय: डिसेम्बर-01-2022
